本文關(guān)鍵詞：Hsp90功能執(zhí)行的動(dòng)力學(xué)分子機(jī)制研究及其變構(gòu)抑制劑發(fā)現(xiàn)　出處：《中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：Hsp90是分子伴侶蛋白家族的重要成員。它能夠輔助完成客戶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)活化或組裝,維持細(xì)胞中蛋白質(zhì)生成與降解的平衡。目前已經(jīng)明確的Hsp90客戶蛋白達(dá)到了~300種,其中包括激素受體、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和激酶等。Hsp90的客戶蛋白質(zhì)名單中包括了一些著名的癌蛋白,通過(guò)調(diào)控與癌癥發(fā)生相關(guān)的客戶蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡,Hsp90可在多個(gè)途徑、多個(gè)環(huán)節(jié)影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程,Hsp90是抗腫瘤藥物研發(fā)的熱門(mén)靶點(diǎn)。Hsp90主要由三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域構(gòu)成:N端ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域、客戶蛋白質(zhì)識(shí)別結(jié)構(gòu)域(中間結(jié)構(gòu)域)和C端二聚化結(jié)構(gòu)域,而其功能執(zhí)行過(guò)程則同時(shí)受到內(nèi)源性小分子(ATP、ADP)和內(nèi)源性生物大分子(共伴侶蛋白p23、Cdc37、Aha1等)的精細(xì)調(diào)控。Hsp90具有ATP水解酶活性,ATP的結(jié)合與水解引發(fā)Hsp90 N端結(jié)構(gòu)域和中間結(jié)構(gòu)域發(fā)生一系列構(gòu)象變化并最終完成對(duì)客戶蛋白質(zhì)的活化或組裝。ATP結(jié)合和水解所引發(fā)的Hsp90的構(gòu)象變化對(duì)于Hsp90整個(gè)功能執(zhí)行過(guò)程的完成至關(guān)重要,然而截至目前為止,我們對(duì)于這一過(guò)程的了解尚未明晰。鑒于ATP水解酶活性對(duì)Hsp90功能執(zhí)行的重要性,ATP結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)抑制劑是目前以Hsp90為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物研發(fā)的主攻方向。截至2015年,已有17個(gè)靶向Hsp90 N端ATP結(jié)合/催化口袋的抑制劑進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段,然而迄今為止,尚未有相關(guān)藥物成功獲批上市,化合物的毒副作用是導(dǎo)致這種結(jié)果的最重要原因。開(kāi)發(fā)靶向Hsp90中間結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)抑制劑有望實(shí)現(xiàn)在抑制腫瘤進(jìn)程的同時(shí)規(guī)避相關(guān)毒副作用的產(chǎn)生。基于Hsp90的上述研究現(xiàn)狀,在本論文工作中,我們主要利用NMR實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)ATP依賴(lài)的Hsp90的構(gòu)象變化過(guò)程進(jìn)行探討,嘗試在原子水平闡明Hsp90功能執(zhí)行的動(dòng)力學(xué)分子機(jī)制。此外,在結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究基礎(chǔ)上使用基于片段的活性化合物發(fā)現(xiàn)技術(shù)嘗試獲得靶向Hsp90中間結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)抑制劑,并在分子水平解析這些新型抑制劑的效應(yīng)機(jī)制及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),這些抑制劑有可能發(fā)展為毒副作用較小的抗腫瘤藥物。為了闡明ATP依賴(lài)的Hsp90 N端結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化的動(dòng)力學(xué)分子機(jī)制,在本論文的第一部分工作中,我們開(kāi)展了基于核磁共振技術(shù)的自由態(tài)Hsp90 N端結(jié)構(gòu)域及其與amppcp(atp類(lèi)似物)和adp所形成復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)行為研究。[1h,15n]hsqc滴定實(shí)驗(yàn)、動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)和核磁信號(hào)線形分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示:amppcp和adp二者與hsp90的結(jié)合模式整體上相類(lèi)似,然而,它們的結(jié)合對(duì)介導(dǎo)hsp90n端結(jié)構(gòu)域二聚化的lid片段及其附近區(qū)域(l107-a141:其中l(wèi)id區(qū)域?yàn)閍111-g135)的影響具有顯著差異:amppcp的結(jié)合增強(qiáng)了hsp90lid區(qū)域在?s-ms時(shí)間尺度上的慢構(gòu)象交換運(yùn)動(dòng),而adp的結(jié)合使得lid區(qū)域變得更為剛性,與nmr動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相一致,itc實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示hsp90n端結(jié)構(gòu)域和adp的結(jié)合過(guò)程伴隨熵值減小。依據(jù)核磁共振動(dòng)力學(xué)和itc實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們提出了atp/adp依賴(lài)的hsp90n端結(jié)構(gòu)域構(gòu)象轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)工作模型:在靜息狀態(tài)下,hsp90n端結(jié)構(gòu)域中的lid片段以包括高能“關(guān)閉”構(gòu)象在內(nèi)的多種構(gòu)象狀態(tài)存在,atp的結(jié)合將通過(guò)提高lid區(qū)域在?s-ms時(shí)間尺度上活動(dòng)性而增加高能“關(guān)閉”構(gòu)象的占比,在hsp90中間結(jié)構(gòu)域和其它輔因子的進(jìn)一步幫助下,hsp90n端結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚化,在二聚體中,lid片段區(qū)域以“關(guān)閉”構(gòu)象狀態(tài)存在。在atp水解為adp分子后,hsp90n端結(jié)構(gòu)域的lid片段區(qū)域活動(dòng)性顯著下降,在溶液中主要以惰性構(gòu)象存在。在隨后的工作中,我們使用hsp90αnmΔ樣品開(kāi)展了[1h,15n]hsqc滴定實(shí)驗(yàn),考察了中間結(jié)構(gòu)域?qū)sp90n端結(jié)構(gòu)域adp/atp(amppcp)識(shí)別結(jié)合過(guò)程的影響,結(jié)果顯示,adp/amppcp與hsp90αnmΔn端結(jié)構(gòu)域和中間結(jié)構(gòu)域的作用模式與adp/amppcp和單獨(dú)存在時(shí)的n端結(jié)構(gòu)域及中間結(jié)構(gòu)域的作用模式一致。在使用hsp90αnmΔ樣品的情況下,由adp/amppcp結(jié)合所引發(fā)的hsp90構(gòu)象變化主要集中在其n端結(jié)構(gòu)域。在本論文的第二部分工作中,我們開(kāi)展了靶向hsp90中間結(jié)構(gòu)域的基于核磁共振技術(shù)的陽(yáng)性化合物篩選,獲得了陽(yáng)性化合物1個(gè)(1-e6),隨后,我們使用基于[1h,15n]hsqc滴定實(shí)驗(yàn)的化學(xué)擾動(dòng)分析方法完成了對(duì)hsp90中間結(jié)構(gòu)域:1-e6復(fù)合物結(jié)構(gòu)的初步表征,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步完成了對(duì)1-e6的初步結(jié)構(gòu)優(yōu)化,獲得了與hsp90中間結(jié)構(gòu)域的結(jié)合強(qiáng)度(結(jié)合解離常數(shù)kd)在百?m水平的活性化合物兩個(gè):16-171和16-175。在后續(xù)工作中,我們使用核磁共振技術(shù)對(duì)兩個(gè)活性化合物的分子水平效用機(jī)制進(jìn)行了研究,研究結(jié)果顯示,這兩個(gè)活性化合物對(duì)Hsp90的功能執(zhí)行具有變構(gòu)調(diào)節(jié)效應(yīng),它們與中間結(jié)構(gòu)域的結(jié)合導(dǎo)致Hsp90 N端結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生改變,由中間結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)產(chǎn)生的另一種Hsp90 N端結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定構(gòu)象近于完全消失,而16-171和16-175的這種變構(gòu)調(diào)節(jié)效應(yīng)不受激活型共伴侶因子Aha1存在與否的影響,但是當(dāng)另一抑制型共伴侶因子P23存在時(shí),它們施加于Hsp90的變構(gòu)調(diào)節(jié)效應(yīng)消失。此外,細(xì)胞水平的腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)顯示:16-171和16-175具有十?M~百?M水平的人乳腺癌SKBR3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性。
[Abstract]:Hsp90 is an important target for the development of Hsp90 . At present , there have been a series of conformational changes in Hsp90 , including hormone receptors , transcription factors , cell cycle regulatory proteins and kinases . In the second part of this thesis , we investigated the effect of the binding process on the domain of the Hsp90n terminal domain . The results showed that the binding process of the two domains of the Hsp90n - terminal domain was significantly different from the experimental data . In the second part of this thesis , we carried out the screening of the positive compounds based on the nuclear magnetic resonance technology of the middle domain of the Hsp90 . However , when another inhibitory copartner factor P23 is present , they are applied to the altered regulatory effect of Hsp90 . In addition , tumor cell proliferation inhibition experiments at cell levels show that 16 - 171 and 16 - 175 have 10 ? M to 100 ? M levels of human breast cancer SKBR3 cell growth inhibitory activity .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R91

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本文編號(hào)：1377369