本文關(guān)鍵詞：AF1q、CD44和circRNA在白血病中的作用及機制研究　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分AF1q調(diào)控CD44在慢性髓性白血病細胞增殖及耐藥中的作用及機制研究研究背景:慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是一種起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病,Ph染色體和BCR/ABL融合基因是CML的標(biāo)記性改變。BCR/ABL蛋白具有活躍的酪氨酸激酶活性,可促使造血干細胞向髓系祖細胞分化,引發(fā)髓系細胞擴增并抑制其凋亡,最終導(dǎo)致CML的發(fā)生。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)能選擇性抑制BCR/ABL蛋白的酪氨酸激酶活性,可顯著改善CML患者的預(yù)后,開創(chuàng)了靶向治療的新時代。然而,隨著臨床上的廣泛應(yīng)用和時間的推移,TKI的耐藥現(xiàn)象日益明顯,復(fù)發(fā)率逐漸升高,嚴(yán)重影響了CML的治療效果。因此,探索TKI的耐藥機制,尋找新的治療靶點,成為目前CML研究的熱點之一。AF1q基因(又名MLLT11)定位于人類染色體1q21,是混合譜系白血病基因(mixed-lineage leukemia,MLL)的伙伴基因。研究顯示其表達水平在急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)和急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者中普遍升高,且AF1q高表達在AML及骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)中是一個獨立的預(yù)后不良因素。以上結(jié)果提示,AF1q可能在白血病中發(fā)揮著重要的作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn),AF1q在CML患者中表達升高,而且在CML CD34+白血病干/祖細胞中的升高水平尤為明顯。然而,目前有關(guān)AF1q基因功能的報道極少,其在白血病中發(fā)揮作用的途徑及機制尚不清楚。研究目的:研究AF1q在CML不同分期患者體內(nèi)的表達水平;明確AF1q表達異常對CML細胞增殖及藥物敏感性的影響;探討AF1q在CML中發(fā)揮作用的機制,為逆轉(zhuǎn)伊馬替尼(Imatinib,IM)耐藥、預(yù)防CML復(fù)發(fā)提供新的治療靶點。研究方法:1.標(biāo)本采集及細胞分選:收集149例CML患者和15例健康對照者的骨髓標(biāo)本,應(yīng)用淋巴細胞分離液提取骨髓中的單個核細胞。磁珠法分選13例CML初診慢性期患者和7例健康對照者骨髓標(biāo)本中的CD34+細胞。2.AF1q表達水平檢測:Real-Time RT-PCR檢測CML各期患者和健康對照者骨髓原代細胞及CD34+細胞中AF1q的mRNA表達水平。3.構(gòu)建AF1q表達載體及合成小干擾片段:在293T細胞中包裝攜帶有AF1q表達載體(pLOC-AF1q)和陰性對照質(zhì)粒(pLOC-NC)的慢病毒;合成針對AF1q基因的siRNA和陰性對照片段NC siRNA。4.轉(zhuǎn)染CML細胞系、原代細胞及CD34+細胞:應(yīng)用pLOC-AF1q及pLOC-NC病毒轉(zhuǎn)染K562細胞系(AF1q上調(diào)組與對照組),blasticidin篩選至少2周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞;應(yīng)用Lipofectamine 2000將AF1q siRNA和NC siRNA轉(zhuǎn)染K562/G01細胞系、CML初診原代細胞及CD34+細胞(AF1q下調(diào)組與對照組)。Real-Time RT-PCR和Western blot分別驗證AF1q的上、下調(diào)效率。5.細胞增殖、凋亡及藥物敏感性檢測:將轉(zhuǎn)染后的細胞種于細胞培養(yǎng)板中,CCK8法檢測細胞增殖速度;加入IM孵育48小時,CCK8法檢測藥物敏感性、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率變化。6.動物實驗:NOD/SCID免疫缺陷小鼠經(jīng)1.5Gy射線照射后,尾靜脈注射AF1q上調(diào)組及對照組K562細胞,4周及8周后分別應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測骨髓及脾臟中人源性CD33分子(K562細胞標(biāo)志性表面分子)含量。7.芯片檢測:應(yīng)用全基因組芯片技術(shù)篩選AF1q上調(diào)組及對照組K562細胞之間差異表達的mRNA,針對芯片結(jié)果行GO及pathway分析。8.CD44表達水平檢測:選取芯片結(jié)果中具有差異性表達的CD44作為AF1q下游候選分子。Real-Time RT-PCR檢測CML初診慢性期患者骨髓原代細胞及CD34+細胞中CD44的mRNA表達水平,并分析其與AF1q的相關(guān)關(guān)系。9.封閉CD44分子:在AF1q上調(diào)組K562細胞中,應(yīng)用中和抗體阻斷CD44的生物學(xué)作用,觀察其對細胞增殖、凋亡和藥物敏感性方面的影響。研究結(jié)果:1.CML患者AF1q的表達情況:與健康對照者相比,AF1q在CML各期患者中表達水平均明顯增高,且慢性期(Chronic phase,CP)、加速期(accelerate phase,AP)或急變期(blast phase,BP)患者的表達水平明顯高于CR患者;CR患者的表達水平則顯著高于健康對照者。進一步結(jié)果顯示,CML初診患者CD34+細胞中AF1q的表達水平明顯高于同源CD34-細胞,同時高于健康對照者的CD34+細胞,提示AF1q可能在CML白血病干細胞中發(fā)揮重要作用。2.AF1q表達下調(diào)對細胞凋亡及藥物敏感性的影響:在CML原代細胞及CD34+細胞中下調(diào)AF1q表達后,CCK8結(jié)果顯示細胞對M誘導(dǎo)的藥物敏感性增強,流式細胞術(shù)結(jié)果表明細胞凋亡率增加。3.AF1q表達上調(diào)對細胞增殖、凋亡及藥物敏感性的影響:在IM敏感細胞株K562中上調(diào)AF1q表達后,CCK8結(jié)果顯示細胞增殖速度加快、對IM誘導(dǎo)的藥物敏感性降低,流式細胞術(shù)結(jié)果表明細胞凋亡率減少。同時,在IM耐藥細胞株K562/G01中下調(diào)AF1q表達后,CCK8結(jié)果顯示細胞增殖速度減慢、對IM誘導(dǎo)的藥物敏感性增強,流式細胞術(shù)結(jié)果表明細胞凋亡率增加。以上結(jié)果表明,AF1q可參與調(diào)控CML細胞的增殖、藥敏與凋亡。4.AF1q表達上調(diào)對CML細胞體內(nèi)定植能力的影響:尾靜脈注射細胞4周及8周后,AF1q上調(diào)組小鼠脾內(nèi)K562細胞含量均高于對照組小鼠;骨髓中K562細胞定植較少,4周后兩組小鼠骨髓中K562細胞含量無明顯差異,8周后AF1q上調(diào)組小鼠骨髓中K562細胞含量高于對照組。5.芯片結(jié)果:應(yīng)用全基因組芯片技術(shù)在AF1q上調(diào)組及對照組K562細胞之間篩選出582個差異性表達基因,其中上調(diào)基因465個,下調(diào)基因117個。GO及pathway分析發(fā)現(xiàn),K562過表達AF1q后生物學(xué)行為改變涉及細胞生長、機體發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及刺激應(yīng)答等方面,主要涉及凋亡相關(guān)通路、腫瘤轉(zhuǎn)錄異常調(diào)節(jié)、Ras、PI3K-AKT、mTOR等信號通路。在結(jié)果中選擇表達差異明顯、與白血病發(fā)病與耐藥有密切關(guān)系的CD44作為AF1q下游候選分子。6.CML患者CD44的表達情況以及與AF1q的相關(guān)關(guān)系:在CML初診CP期患者骨髓原代細胞及CD34+細胞中,CD44表達水平與AF1q表達均呈顯著正相關(guān);在CML細胞中上、下調(diào)AF1q表達后,CD44分子表達亦隨之上、下調(diào)。此外,在CD34+細胞中,CD44的表達水平明顯高于同源CD34-細胞。以上結(jié)果提示,在CML中AF1q能正向調(diào)控CD44的表達。7.AF1q通過調(diào)控CD44發(fā)揮生物學(xué)功能:在AF1q上調(diào)組K562細胞中阻斷CD44分子后,CCK8結(jié)果顯示細胞增殖速度減慢、對IM誘導(dǎo)的藥物敏感性增強,流式細胞術(shù)結(jié)果表明細胞凋亡率增加。由此可見,在CML中AF1q可通過調(diào)控CD44發(fā)揮其生物學(xué)功能。結(jié)論:1.AF1q在CML各期患者中的表達水平均高于健康對照者,提示AF1q在CML的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。2.通過調(diào)控AF1q表達水平,可改變CML細胞的增殖速度、藥物敏感性及藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡率,證實AF1q在CML中具有促進增殖、降低藥物敏感性以及抵抗凋亡的作用。3.AF1q在CML中具體作用機制之一是通過調(diào)控CD44的表達介導(dǎo),這兩種分子可能為CML的治療提供新靶點。第二部分circRNA在急性髓性白血病中的表達譜及生物信息學(xué)分析研究背景:急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類異質(zhì)性很強的造血系統(tǒng)惡性疾患,常常伴隨多種遺傳學(xué)及基因?qū)W異常。AML的治療主要以化療為主,但治療過程中出現(xiàn)的耐藥、復(fù)發(fā)以及毒副作用,使病死率一直維持在較高的水平。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展,AML的各類生物學(xué)指標(biāo)逐漸被熟知,其中細胞遺傳學(xué)及分子學(xué)指標(biāo)尤為突出,成為輔助診斷、指導(dǎo)治療及預(yù)后分層的有力工具。近年來,圍繞DNA突變、microRNA及IncRNA等方向的大量研究正廣泛開展,致力于發(fā)現(xiàn)更多的AML生物學(xué)指標(biāo),提高對白血病特點的認識,以助于監(jiān)測微小殘留病變、提高預(yù)警能力和開發(fā)新型靶向治療藥物。環(huán)狀RNA(Circular RNAs,circRNAs)是一類廣泛存在的非編碼RNA,以往的相關(guān)報道較為少見。circRNA具有閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu),不易被降解,因而比同源線性RNA更為穩(wěn)定。在早期的研究中,circRNA被認為形成于外顯子轉(zhuǎn)錄本的錯誤剪接,作為隨機產(chǎn)物并不具備生物學(xué)功能,然而隨著生物信息學(xué)及高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展,大量circRNA被發(fā)現(xiàn)并引起關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明,circRNA并非偶然產(chǎn)生,其豐度高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并存在時空表達特異性,很可能在調(diào)控生物體基因表達過程中發(fā)揮重要作用。另有少量研究報道,circRNA可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著某種作用,然而其在AML疾病進程中的表達及功能尚不清楚。研究目的:研究AML中circRNA的表達譜,篩選出與AML危險度分層相關(guān)的特異性circRNA;尋找circRNA表達譜中潛在的AML診斷指標(biāo)和治療靶點,并對其進行特征鑒定和功能分析。研究方法:1.標(biāo)本采集:收集113例AML患者和12例健康對照者的骨髓標(biāo)本,應(yīng)用淋巴細胞分離液提取標(biāo)本中的單個核細胞。10例標(biāo)本用于circRNA芯片檢測,115例標(biāo)本用于后續(xù)研究。2.芯片檢測:提取10例標(biāo)本(6例AML,4例健康對照)的總RNA并用RNA酶處理,除去線性RNA后轉(zhuǎn)錄為熒光素標(biāo)記的互補RNA,繼而用于芯片雜交。掃描并分析孵育后的雜交芯片,獲得標(biāo)準(zhǔn)化的circRNA表達數(shù)據(jù)。3.Real-Time RT-PCR驗證表達水平:提取115例標(biāo)本的總RNA并轉(zhuǎn)錄為cDNA,應(yīng)用Real-Time RT-PCR檢測并獲取相關(guān)基因的Ct值,GAPDH作為內(nèi)參用于數(shù)據(jù)分析。4.miRNA預(yù)測及功能分析:應(yīng)用Arraystar軟件預(yù)測circRNA-miRNA的相互作用;應(yīng)用 Cytoscape 描繪 circRNA-miRNA-mRNA/gene interaction 網(wǎng)絡(luò)圖;應(yīng)用GO及KEGG分析預(yù)測靶基因的相關(guān)功能及通路。研究結(jié)果:1.AML患者中的circRNA表達譜:在芯片13617個circRNA的檢測范圍內(nèi),4573個circRNA可被檢測到信號,其中464個circRNA在AML中差異性表達,上調(diào)147個,下調(diào)317個。與健康對照者相比,AML患者中12個circRNA的差異表達倍數(shù)高達10倍以上。2.AML危險度分層相關(guān)的特異性circRNA:2.1進一步研究低危及高危組AML患者結(jié)果發(fā)現(xiàn),2個上調(diào)circRNA(hsa_circ_0035381,hsa_circ_0049657)和 3 個下調(diào) circRNA(hsa_circ_0001187,hsa_circ_0008078,hsa_circ_0001947)的表達與 AML 危險度分層相關(guān)。2.2 circRNA可作為miRNA海綿競爭性調(diào)控miRNA的生物活性。GO及KEGG分析以上5個circRNA相關(guān)的miRNA及其靶基因,結(jié)果顯示此類AML危險度分層特異性circRNA可參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程及信號通路。3.hsa_circ_0004277 在 AML 中的表達情況:3.1在AML特異性circRNA表達譜中,選取表達水平較高、下調(diào)倍數(shù)明顯的hsa_circ_0004277作為研究對象,探索其在AML中的表達情況。與健康對照者相比,hsa_circ_0004277在初診未治AML患者中表達水平明顯降低;患者經(jīng)治療達到CR后,hsa_circ_0004277表達得以恢復(fù),與健康對照者無差異;當(dāng)CR患者病情復(fù)發(fā),hsa_circ_0004277表達水平再次降低,與初診未治階段相似。3.2 ROC曲線分析結(jié)果顯示,hsa_circ_0004277的曲線下面積為0.957,作為AML預(yù)后指標(biāo)具有較高潛力。3.3 hsa_circ_0004277同源線性RNA WDR37在初診未治AML患者中表達水平較健康對照組明顯降低,在CR組患者中表達得以恢復(fù),與hsa_circ_0004277情況類似。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,AML患者中hsa_circ_0004277和WDR37的表達水平呈顯著正相關(guān)。4.化療對AML患者hsa_circ_0004277表達水平的影響:在AML患者初診未治階段及CR階段監(jiān)測hsa_circ_0004277的表達變化,針對每一患者兩階段結(jié)果配對分析發(fā)現(xiàn),化療成功后,hsa_circ_0004277表達水平得以顯著提升。5.hsa_circ_0004277的靶向miRNA預(yù)測及生物信息學(xué)分析:circRNA-miRNA-mRNA/gene interaction 網(wǎng)絡(luò)圖顯示,預(yù)測結(jié)果中hsa-miR-138-5p及hsa-miR-30c-1-3p具有較為復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò),hsa-miR-892b,hsa-miR-571,and hsa-miR-328-3p 靶基因則相對較少。其中,SH3GL2,PPARGC1A,PIP4K2C,SH2B3,ZNF275 及 ATP1B4 六個靶基因受到2個miRNA調(diào)控。結(jié)論:1.circRNA芯片結(jié)果展示了 AML患者中的circRNA表達譜,從中篩選出了 5個與AML危險度分層相關(guān)的特異性circRNA;2.hsa_circ_0004277在AML中具有特異性表達,可作為潛在的AML診斷指標(biāo)和治療靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.7

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