發(fā)布時間：2018-01-03 06:23

  本文關(guān)鍵詞：菊非藥用部位多糖類物質(zhì)干預(yù)炎癥性腸病的效應(yīng)機(jī)制研究　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 菊非藥用部位多糖 炎癥性腸病 菌群多樣性 短鏈脂肪酸 信號通路 代謝組學(xué) 結(jié)構(gòu)組成

【摘要】：菊屬藥用植物資源的利用目前主要以其頭狀花序中的黃酮類、揮發(fā)油及有機(jī)酸類化合物的研究為主,而對菊屬植物中多糖等大分子物質(zhì)的研究相對粗淺,主要涉及其多糖的提取、分離、簡單純化及活性篩選等,其中對菊非藥用部位多糖的研究則僅有本團(tuán)隊前期的初步研究工作。根據(jù)課題組前期預(yù)實驗結(jié)果,表明菊根、莖、葉總多糖的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菊花中的含量(81.0%vs 8.62%),在經(jīng)水提醇沉、sevage法除蛋白之后,菊非藥用部位多糖表現(xiàn)出抗氧化、抗凝血、抗腫瘤細(xì)胞生長、神經(jīng)保護(hù)作用、調(diào)節(jié)腸道菌群的生長以及對結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)作用等生物活性,鑒于此,本課題以原有工作基礎(chǔ)為背景,對菊非藥用部位多糖干預(yù)炎癥性腸病的效應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步驗證,并對其可能存在的機(jī)制進(jìn)行探討,基于此活性導(dǎo)向性,對菊非藥用部位多糖進(jìn)行提取、分離、純化以及結(jié)構(gòu)的表征,為深入開展菊非藥用部位多糖的研究利用奠定科學(xué)依據(jù)。本論文共分四章節(jié)內(nèi)容。一、文獻(xiàn)研究本部分在對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行整理、歸納和總結(jié)的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)總結(jié)了菊多糖的結(jié)構(gòu)特征、分離與鑒定方法及菊多糖生物活性的研究現(xiàn)狀,以期為開展菊非藥用部位多糖的活性與結(jié)構(gòu)研究提供科學(xué)參考。同時,對多糖類物質(zhì)對機(jī)體腸道屏障功能紊亂及其引發(fā)的相關(guān)疾病的干預(yù)和治療作用進(jìn)行梳理和總結(jié),為開展菊非藥用部位多糖干預(yù)炎癥性腸病-結(jié)腸炎的效應(yīng)機(jī)制研究提供理論支撐。二、實驗研究(一)菊非藥用部位多糖類物質(zhì)資源價值發(fā)現(xiàn)1.多糖類物質(zhì)免疫調(diào)節(jié)作用和抑制腫瘤細(xì)胞生長研究1.1本實驗采用免疫抑制劑環(huán)磷酰胺來復(fù)制小鼠免疫功能低下模型,用以考察菊非藥用部位多糖對其誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用,結(jié)果表明,菊多糖JFP能顯著提升免疫低下小鼠的的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù),能明顯增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬活力,使單位時間內(nèi)血液中碳粒清除速率加快,表明JFP對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠的免疫功能具有一定程度的保護(hù)和改善作用。1.2應(yīng)用MTT細(xì)胞增殖檢測法測定樣品對人腸癌細(xì)胞體外增殖的影響。結(jié)果表明,JFP對人腸癌細(xì)胞LOVO,HCT-116,SW480和CAC02的生長具有一定程度的抑制作用,進(jìn)一步驗證,JFP對炎癥性腸病改善的積極作用,為將來開發(fā)利用菊非藥用部位多糖提供科學(xué)依據(jù)。2.結(jié)腸炎模型的建立及多糖類物質(zhì)的效應(yīng)評價2.1采用TNBS/乙醇灌腸方法成功誘導(dǎo)了大鼠結(jié)腸炎,表現(xiàn)在造模后大鼠出現(xiàn)體重下降、稀水便及血便。結(jié)腸外觀及組織病理學(xué)檢測可見結(jié)腸增厚、潰瘍形成,并且MPO活性較正常對照組顯著升高。JFP中、低劑量(100、50mg/kg)干預(yù)兩周后,對其腸炎癥狀具有較好的緩解作用,可回調(diào)結(jié)腸炎大鼠體重及DAI值,可減輕結(jié)腸外觀及鏡下炎癥病變,且顯著降低MPO酶活性(P0.05)。高劑量組(200 mg/kg)大鼠炎癥癥狀,大鼠結(jié)腸外觀損傷及MPO活性略有下降,但與模型組相比,無統(tǒng)計學(xué)意義。此外,多糖組顯著降低結(jié)腸組織黏膜中TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-1 β和IL-23的含量,同時提升IL-13、IL-10和IL-4的水平,尤其以中、低劑量效果更為顯著。結(jié)果提示,不同劑量JFP對大鼠結(jié)腸炎的療效存在差異,中、低劑量優(yōu)于高劑量,與陽性治療藥柳氮磺胺吡啶接近。2.2采用DSS法成功建立了 C57BL6小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型,考察了 JFP不同劑量、不同給藥方式對模型小鼠結(jié)腸炎的影響。結(jié)果顯示,中、低劑量多糖組對模型小鼠的炎癥反應(yīng)具有較好的改善作用,尤其以邊造模邊給藥的方式為佳。具體表現(xiàn)為降低炎癥小鼠DAI、緩解病理組織損傷、降低組織學(xué)評分,改善腸炎小鼠腹瀉、便血狀況,降低結(jié)腸組織MPO活性、NO含量,回升組織SOD活性等。(二)菊非藥用部位多糖干預(yù)結(jié)腸炎的效應(yīng)機(jī)制研究1.菊非藥用部位多糖對結(jié)腸炎大鼠腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用1.1基于細(xì)菌16S V3-V4可變區(qū),利用Illumina/Miseq二代測序技術(shù)平臺進(jìn)行高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法,研究JFP對TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明,與正常組相比,模型組大鼠腸道菌群組成發(fā)生明顯變化,其中Firmicutes/Bacteroidetes比例顯著降低,而多糖的攝入明顯改善了這種趨勢,Firmicutes數(shù)量增多,二者比值回升,基本維持了腸道菌群的生態(tài)平衡。此外,病原微生物如Escherichia、Enterococccs和prevotella的相對豐度顯著降低,有益微生物如Butyricicoccus、Clostridium、Lachnospiraceae、Rikenellaceae、Lactobacillus和Bifidobacterium的相對豐度明顯增加。通過腸道菌群與生化因子的關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)Butyricicoccus、Clostridium、Lachnospiraceae、Rikenellaceae、Lactobacillus、Bifidobacterium等有益菌與抗炎因子 IL-4、IL-10、IL-11 呈顯著正相關(guān)(P0.01),而 Prevotella、Ruminococcus、Bacteroides、Escherichia-Shigella、Akkermansia、Turicibacter等有害菌與 IL-23、TNF-α、IL-1β、IL-6、IF-17、IFN-γ 等促炎因子水平呈顯著正相關(guān)(P0.01)。同時,基于COG數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫對腸道菌群的相關(guān)生化功能進(jìn)行預(yù)測,主要涉及氨基酸代謝、細(xì)胞運(yùn)動、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、葡聚糖生物合成與代謝、脂代謝、細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、輔酶和維生素代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長和調(diào)亡等多種生理功能,在上述功能中,正常組與模型組在能量代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞壁/膜的合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面有較為明顯的差異,模型動物在攝入多糖后,這些差異的生理功能均有接近正常組的趨勢,尤以中、低劑量給藥組更為顯著。本實驗研究從不同分類學(xué)水平上發(fā)掘?qū)辗撬幱貌课欢嗵瞧痦憫?yīng)的關(guān)鍵菌屬,分析JFP對結(jié)腸炎大鼠癥狀的改善作用,評價菊非藥用部位多糖對結(jié)腸炎的干預(yù)效應(yīng),為中藥多糖在治療炎癥性腸病的藥物研究與應(yīng)用方面提供新的思路。1.2采用GC-FID分析方法,測定了結(jié)腸炎大鼠腸道內(nèi)容物中SCFAs的含量變化,結(jié)果表明,JFP在不同程度上增加了結(jié)腸炎大鼠腸道內(nèi)SCFAs的含量,其中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸的含量在模型動物腸道內(nèi)顯著升高,該結(jié)果與腸道菌群多樣性的變化較為一致,提示:JFP可能通過改善結(jié)腸炎大鼠腸道菌群的失衡,恢復(fù)腸道菌群的代謝功能,增強(qiáng)腸道菌群產(chǎn)生SCFAs的能力,從而緩解和改善結(jié)腸炎的癥狀。2.菊非藥用部位多糖干預(yù)炎癥性腸病的分子機(jī)制研究2.1研究證實,上皮屏障功能受損,導(dǎo)致腸道細(xì)菌和其它抗原滲透進(jìn)入腸道黏膜是炎癥性腸病發(fā)病的主要因素之一。在本章節(jié)研究中,我們選擇Claudin、Occludin與ZO-1作為研究對象,分析其在大鼠結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)情況,結(jié)果表明,腸黏膜上的Claudin-1、Occludin與ZO-1在正常組大鼠體內(nèi)均有較高的表達(dá),模型組大鼠腸道上述蛋白的表達(dá)明顯降低,而模型組大鼠給予菊非藥用部位多糖后,提高了 Claudin-1、Occludin與ZO-1在mRNA與蛋白水平上的表達(dá),尤以中、低劑量組的效果更為顯著。結(jié)合前后研究結(jié)果我們推測,菊多糖通過調(diào)控腸道菌群多樣性,恢復(fù)腸道生物屏障的保護(hù)功能,使得腸道黏膜上皮細(xì)胞上的某些緊密連接蛋白的表達(dá)水平恢復(fù)正常,進(jìn)而增強(qiáng)腸道黏膜的屏障功能,緩解和改善TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠癥狀。2.2大量研究證實,機(jī)體腸道微生態(tài)平衡的打破與炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。炎癥性腸病患者存在腸道菌群失調(diào),保護(hù)性微生物和侵襲性微生物生態(tài)平衡被打破,在各種微生物抗原刺激下,體內(nèi)免疫系統(tǒng)被過度激活,各種炎癥細(xì)胞活化,導(dǎo)致細(xì)胞因子的失衡,產(chǎn)生腸道慢性炎癥反應(yīng)。本章節(jié)圍繞TLR4/NF-κ B信號通路,利用qPCR和western blot技術(shù)分別從基因和蛋白水平檢測了 NF-κB、TLR4的表達(dá)水平。qPCR結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,模型大鼠結(jié)腸組織黏膜NF-κB、TLR4表達(dá)水平均顯著提高,且具有統(tǒng)計學(xué)意義。而不同劑量菊非藥用部位多糖對模型大鼠黏膜組織NF-κB、TLR4mRNA表達(dá)水平具有不同程度的回調(diào)作用;Western blot結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,模型大鼠結(jié)腸組織黏膜p65及其磷酸化pp65、TLR4蛋白表達(dá)水平均顯著提高,多糖不同劑量組對結(jié)腸炎大鼠黏膜組織p65及其磷酸化pp65表達(dá)水平具有不同程度的回調(diào)作用,尤其是對P65蛋白表達(dá)水平的降低具有極顯著差異。上述研究結(jié)果提示,菊非藥用部位多糖可通過阻斷TLR4/NF-κB通路途徑,抑制TLR4、NF-κB的表達(dá),繼而減輕腸道炎癥反應(yīng)。此外,開展了 JFP對IL-6/STAT3信號通路的影響研究,分別從基因和蛋白水平檢測了 IL-6、JAK2、STAT3基因轉(zhuǎn)錄水平及STAT3、p-STAT3、p-JAK2蛋白表達(dá)水平。qPCR結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,模型大鼠結(jié)腸組織黏膜IL-6、JAK2、STAT3mRNA表達(dá)水平均顯著提高,而模型大鼠給予JFP后,IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著降低,JAK2、STAT3 mRNA只在低劑量組呈顯著性差異,而在高、中劑量組沒有明顯差異。然而,Westernblot結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,模型大鼠結(jié)腸組織黏膜STAT3及其磷酸化蛋白p-STAT3及p-JAK2表達(dá)水平均顯著提高,該蛋白與其基因表達(dá)不一致,表明IL-6/STAT3通路在蛋白翻譯后對菊多糖產(chǎn)生響應(yīng)。當(dāng)腸道微生物與宿主之間的平衡被打破,革蘭陰性細(xì)菌數(shù)量增加,LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB、IL-6/STAT3途徑就被過度激活,炎癥反應(yīng)被放大,導(dǎo)致炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展。因此,維持腸道微生態(tài)平衡,抑制或阻斷TLR4-NF-κB、IL-6/STAT3信號通路,將有助于控制和改善炎癥性腸病病情及預(yù)防其復(fù)發(fā)。2.3基于代謝組學(xué)的思路與方法,探尋炎癥性腸病大鼠病理狀態(tài)下血漿、尿液代謝物組的整體變化,在篩選、鑒定其血漿和尿液中潛在的生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)上,研究JFP干預(yù)后的代謝變化規(guī)律,挖掘JFP改善和緩解炎癥性腸病的可能機(jī)制。實驗結(jié)果顯示,結(jié)腸炎大鼠血漿中亞油酸、花生四烯酸、牛磺脫氧膽酸、膽酸、鵝去氧膽酸等表現(xiàn)為下調(diào)趨勢,白三烯A4、甘氨酸、二氫神經(jīng)酰胺、膽固醇等表現(xiàn)為上調(diào)趨勢。涉及代謝通路包括膽汁酸生物合成、視黃醇代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、色氨酸代謝、不飽和脂肪酸生物合成、氨基酸代謝、甘油磷脂代謝、類固醇激素生物合成,其中影響較高的代謝通路有花生四烯酸代謝、膽汁酸生物合成、甘油磷脂代謝;結(jié)腸炎大鼠尿液中,煙酰胺、甘油磷酰膽堿、尿刊酸、煙酸單核苷酸、二氫尿嘧啶、磷酰膽堿等表現(xiàn)為下調(diào)趨勢,D-葡糖醛酸-6,3-內(nèi)酯、甲基咪唑乙酸、2-氧代-4-甲硫基丁酸等表現(xiàn)為上調(diào)趨勢。涉及代謝通路包括煙堿和煙酰胺代謝、組氨酸代謝、賴氨酸降解、甘油磷脂代謝、賴氨酸生物合成、泛酸和CoA生物合成、β-丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、肌醇磷酸代謝、嘧啶和嘌呤代謝等。從代謝通路方面分析,抗壞血酸代謝、煙堿和煙酰胺代謝、甘油磷脂代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝和組氨酸代謝影響值相對較高。JFP可影響上述代謝途徑,對上述標(biāo)志物的水平均有不同程度的回調(diào),向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變,說明菊非藥用部位多糖能改善和緩解結(jié)腸大鼠的癥狀。(三)基于活性導(dǎo)向下的菊非藥用部位均一多糖的制備及結(jié)構(gòu)表征1.菊非藥用部位均一多糖的制備稱取菊根、莖、葉部位干燥樣品2 kg,石油醚脫脂兩次,加熱回流提取,合并兩次提取液后濃縮,乙醇沉淀,得菊非藥用部位粗多糖;對粗多糖中所含中性多糖、酸性多糖以及蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,中性多糖和酸性多糖分別為42.67±2.94%和18.36±1.09%,蛋白質(zhì)含量為6.17±1.02%。由此可見,中性多糖是粗多糖中的主要組成成分。此外,采用三氯乙酸法除蛋白,大孔吸附樹脂AB-8對粗多糖進(jìn)行脫色、除雜,再經(jīng)DEAE-52纖維素柱進(jìn)行不同梯度的洗脫,最后經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-200柱層析進(jìn)一步精制、純化,經(jīng)洗脫、收集、減壓濃縮、透析、冷凍干燥后,獲得含量及純度相對較高的均一性多糖 JFP1-1-2(1.6%)和 JFP1-2-2(0.4%)。2.菊非藥用部位均一多糖的結(jié)構(gòu)表征采用傅里葉紅外光譜IR、酸水解、甲基化、13C-NMR,1H-NMR核磁共振等方法,對均一多糖JFP1-1-2和JFP1-2-2的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,JFP1-1-2主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖以摩爾比4.53:3.06:1.00組成;JFP1-2-2主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及半乳糖醛酸以摩爾比3.01:2.36:1.25:1.00:1.02組成。將此兩種多糖經(jīng)甲基化并水解后,采用 GC/MS 分析,結(jié)果顯示,JFP1-1-2 中含有T-β-D-Manp、5,6-β-Manp、1,3,5-β-D-Manp、1,3-β-D-Manp、1,5-β-D-Galp、T-β-D-Galp、2,4-β-D-Galp、1,3,5-β-D-Glcp和 2,3,4-β-D-Glcp 連接順序的糖殘基,其摩爾比為 13.41:3.39:30.30:1.87:18.01:6.22:15.10:7.01:4.69;JFP1-2-2 中含有 T-β-D-Manp、5,6-β-D-Manp、1,4-β-D-Manp、1,3,5-β-D-Manp、2,3,5-β-D-Manp、1,5-β-D-Galp、2,4-β-D-Galp、1,3,5-β-D-Glcp、T-β-D-Xylp 連接順序的糖殘基,其摩爾比為 2.31:0.44:1.12:2.6:2.86:5.87:3.33:4.56:4.80。由此可見,不論是中性多糖JFP1-1-2,還是帶有酸性基團(tuán)的JFP1-2-2,其糖結(jié)構(gòu)中甘露糖的含量比例最大。而研究報道甘露糖受體MR可特異性地識別以甘露糖為末端的配體,介導(dǎo)吞噬病原微生物,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本實驗研究表明,菊非藥用部位多糖結(jié)構(gòu)中含有大量的甘露糖,可能易于結(jié)合巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞膜表面上的甘露糖受體,消除病原微生物,改善腸道微生態(tài)平衡,進(jìn)而改善模型大鼠炎癥性腸病的癥狀。這一假說,將在后續(xù)的實驗研究中繼續(xù)探討和證實。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊楠楠;王金泉;;腸道黏膜免疫功能異常與IgA腎病[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2016年05期

2 陳丹;周冬林;陳宇;;煙酰胺在治療維持性血液透析尿毒癥高磷血癥患者中的臨床應(yīng)用[J];中國當(dāng)代醫(yī)藥;2016年29期

3 陶金華;段金廒;錢大瑋;劉培;宿樹蘭;郭盛;錢怡云;;菊屬藥用植物資源化學(xué)研究進(jìn)展[J];中國現(xiàn)代中藥;2016年09期

4 未志勝;邵理;楊金娟;冶福俊;;新疆昆侖雪菊多糖的分離純化及其結(jié)構(gòu)的初步鑒定[J];中國釀造;2016年07期

5 閆寧;郭東鋒;姚忠達(dá);竇玉青;劉新民;張忠鋒;;煙草秸稈還田對土壤細(xì)菌多樣性的影響[J];江西農(nóng)業(yè)學(xué)報;2016年05期

6 史晶晶;時博;苗明三;;黃芪多糖對環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J];中醫(yī)學(xué)報;2016年02期

7 田鋒;王新穎;;腸道菌群與腸黏膜固有免疫[J];外科理論與實踐;2016年01期

8 趙平;董蕾;羅金燕;管海濤;宋亞華;龔均;;DSS與TNBS誘導(dǎo)大鼠實驗性結(jié)腸炎模型的對比研究[J];胃腸病學(xué);2015年11期

9 趙海梅;黃敏芳;劉端勇;徐榮;王馨;鄒勇;岳海洋;黃小英;;黃芪多糖對急性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜PI3K/Akt信號的調(diào)控作用[J];中成藥;2015年09期

10 秦建鮮;黃鎖義;;中藥多糖相對分子質(zhì)量測定方法的概述[J];中國實驗方劑學(xué)雜志;2015年14期

，

本文編號：1372754