本文關(guān)鍵詞：自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）在蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦損傷中的作用機(jī)制研究　出處：《南京大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景:蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是病死、致殘比例較高的疾病,生存者常伴隨不同程度神經(jīng)功能損害。有研究證明SAH后繼發(fā)性腦損傷機(jī)制復(fù)雜,即使采用積極有效的治療手段,患者預(yù)后依然欠佳。自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells,NK cells)是固有免疫中重要的識(shí)別、效應(yīng)細(xì)胞,參與機(jī)體抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等進(jìn)程,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)非感染性疾病病程中扮演重要角色。研究目的:從免疫致病機(jī)理的角度出發(fā),對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血的分子機(jī)制進(jìn)行探討,并首次將NK細(xì)胞這一重要固有免疫細(xì)胞引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血性疾病的研究,通過臨床病例回顧研究與實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究相結(jié)合的方式,探討NK細(xì)胞在蛛網(wǎng)膜下腔出血中的重要價(jià)值。研究方法:前期研究中我們采集腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織行免疫組織化學(xué)染色,分析NK細(xì)胞表面受體配體B7-H6表達(dá)與臨床參數(shù)的相關(guān)性。通過RNA干擾技術(shù),觀察下調(diào)B7-H6表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系增殖、遷移、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期等細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,從而印證NK細(xì)胞及其表面分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)非感染性疾病中的重要作用。第二步通過采集臨床蛛網(wǎng)膜下腔出血患者臨床資料以及外周血標(biāo)本,基于流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞及其亞群比例隨時(shí)間相變化情況,應(yīng)用Logistics回歸分析和Kaplan-Meier生存分析評(píng)價(jià)NK細(xì)胞相關(guān)數(shù)值的臨床價(jià)值。第三步構(gòu)建大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,通過免疫組織化學(xué)、熒光染色,以及Western blot、實(shí)時(shí)定量RNA方式驗(yàn)證SAH后腦組織中NK細(xì)胞浸潤程度,以及相關(guān)時(shí)間相數(shù)據(jù)是否能與臨床結(jié)果具有一致性。第四步構(gòu)建小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,通過腹腔注射單抗的方式下調(diào)NK細(xì)胞數(shù)量。通過神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分、免疫組化及免疫印跡的方式驗(yàn)證下調(diào)NK細(xì)胞對(duì)SAH小鼠模型神經(jīng)功能,以及對(duì)腦內(nèi)經(jīng)典Wnt/β-Catenin神經(jīng)保護(hù)通路的影響。結(jié)果:前期研究:NK細(xì)胞表面受體配體B7-H6在人腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),且不同病理類型(Z/x2=23.935,P0.001)、WHO 分級(jí)(Z/x2=3.008,P0.01)以及組織類型(Z/x2=13.908,P＜0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B7-H6下調(diào)后72h,細(xì)胞系增殖水平明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,24h后B7-H6下調(diào)組的細(xì)胞系劃痕愈合速度低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明,B7-H6下調(diào)組與對(duì)照組相比,24h后侵入的細(xì)胞數(shù)量顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。細(xì)胞周期分析結(jié)果表明,下調(diào)B7-H6表達(dá)后,G1期細(xì)胞比例增多,G2/M期細(xì)胞比例減少,細(xì)胞周期出現(xiàn)阻滯。臨床研究:蛛網(wǎng)膜下腔出血患者不同時(shí)間相的外周血中NK細(xì)胞百分比以及亞群組成上存在明顯差異,3-6日時(shí)NK細(xì)胞百分比明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.77,P0.01);NK 細(xì)胞亞群比例(CD16+CD56bright 亞群相對(duì) CD16+CD56dim的比例)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.57,P＜0.01)。根據(jù)SAH后3-6日NK細(xì)胞亞群比例將患者分為兩組,組間Hunt-Hess具有顯著差異(F=10.33,P0.01)。分組間患者死亡事件具有顯著差異(x2=7.19,P=0.02),改良Rankin評(píng)分有顯著差異(F=10.46,P0.01),生存也具有顯著差異(x2=7.198,P=0.007)。有序Logistics回歸分析示NK細(xì)胞亞群比例對(duì)改良Rankin評(píng)分具有顯著影響(P=0.004,95%CI:1.106-5.762)。大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯拷Y(jié)果:在SAH后24h出現(xiàn)NK細(xì)胞浸潤(F=42.62,P0.0001)。在24h時(shí)腦組織中NK細(xì)胞表面受體CXCR3蛋白表達(dá)顯著升高(F=10.62,P0.05),48h 時(shí)同樣升高(F=6.13,P＜0.05)。KLRC3 在 24h時(shí)顯著升高(F=5.98,P0.05)。NK細(xì)胞招募相關(guān)蛋白IP-10 mRNA在SAH后6h表達(dá)升高(F=16.19,P0.05)。IFN-γ mRNA在12h時(shí)表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.90,P0.05)。穿孔素Prf-1mRNA在12h、24h時(shí)表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.70,P0.05;F=14.58,P0.05)。小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯拷Y(jié)果:NK細(xì)胞下調(diào)組與對(duì)照抗體組相比神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.18,P0.05)。SAH后24h時(shí)Wnt通路中APC蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.84,P0.01):β-連環(huán)蛋白下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.59,P0.05);磷酸化β-連環(huán)蛋白蛋白表達(dá)上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.01,P0.01);下游Survivin蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.50,P0.01)。結(jié)論:NK細(xì)胞及其表面分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)非感染性疾病中起到重要作用:在蛛網(wǎng)膜下腔出血中外周血NK細(xì)胞及其亞群比例變化具有臨床預(yù)判價(jià)值。NK細(xì)胞在SAH后腦組織中浸潤,在腦損傷中可能通過激活Wnt通路起到神經(jīng)保護(hù)作用。
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【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743.35

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳萍萍;石松生;陳春美;;膠質(zhì)瘤患者圍手術(shù)期外周血T細(xì)胞亞群和自然殺傷細(xì)胞活性的變化及其臨床意義[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2014年11期

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本文編號(hào)：1355075