本文關(guān)鍵詞：基于VDR調(diào)控NF-κB信號(hào)通路探討銀屑Ⅰ號(hào)治療尋常型銀屑病的作用機(jī)制　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:1.觀察尋常型銀屑病患者皮損組織VDR、NF-κB、IκB蛋白表達(dá)差異,分析蛋白表達(dá)差異與疾病嚴(yán)重程度、中醫(yī)辨證分型的相關(guān)性,為中醫(yī)辨證分型及臨床用藥提供客觀參考依據(jù)。2.觀察不同濃度銀屑I號(hào)含藥血清對(duì)TNF-a誘導(dǎo)銀屑病細(xì)胞模型細(xì)胞因子(25HVD3、INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22)及VDR、NF-κB、IκB蛋白、基因表達(dá)水平的影響,以初步闡明銀屑I號(hào)治療尋常型銀屑病的作用機(jī)制,為銀屑I號(hào)的臨床推廣提供理論依據(jù)。3.腺病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定VDR-/-Hacat細(xì)胞株,觀察不同濃度銀屑I號(hào)含藥血清對(duì)靶基因沉默的Hacat細(xì)胞模型細(xì)胞因子及VDR、NF-κB、IκB蛋白、基因表達(dá)水平的影響,以深入探討銀屑I號(hào)抑制炎癥反應(yīng)的作用靶點(diǎn),為課題組后期深層次研究奠定基礎(chǔ)。方法:臨床研究部分本課題參考尋常型銀屑病的中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)共納入病例102人,并進(jìn)行中醫(yī)辨證,入組患者均來(lái)源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科門(mén)診及住院部,正常人皮膚組織由廣大整形美容醫(yī)院整形外科提供�；颊吆炇鹬橥鈺�(shū)后,參考銀屑病皮損面積及嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)行銀屑病面積及嚴(yán)重程度指數(shù)(Psoriasis Area and Severity Index,PASI)評(píng)分,分別對(duì)入組病例行組織病理染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)。采用Image-proplus 6.0圖像分析軟件測(cè)定目標(biāo)蛋白(VDR、NF-κB、IκB)積分光密度(integral optical density,IOD)。比較正常組、銀屑病組 VDR、NF-κB、IκB 蛋白表達(dá)差異,分析蛋白表達(dá)與PASI評(píng)分的相關(guān)性;比較血熱證、血虛證、血瘀證各組VDR、NF-κB、IκB蛋白表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)研究部分1.銀屑I號(hào)含藥血清對(duì)銀屑病細(xì)胞模型的影響分組:空白組(BG)、模型組(MG)、銀屑I號(hào)低劑量組(LD)、銀屑I號(hào)中劑量組(MD)、銀屑I號(hào)高劑量組(HD),其中空白組不予造模,按照常規(guī)操作細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù),MG、LD、MD、HD各組均予TNF-a誘導(dǎo)造模,并予相應(yīng)血清培養(yǎng)。分別采用酶聯(lián)免疫吸附法(E1ISA)檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清 25HVD3、INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 濃度;實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)各組 VDRmRNA、NF-κBmRNA、IκBmRNA 表達(dá)水平;蛋白印跡法(WesternBlot)檢測(cè)Hacat細(xì)胞VDR、NF-κB、IκB蛋白表達(dá)水平。2.VDR-/-細(xì)胞模型構(gòu)建及驗(yàn)證分組:VDR-NC組、VDR-433組、VDR-544組、VDR-775組,慢病毒質(zhì)粒均由蘇州吉瑪提供,遵照慢病毒轉(zhuǎn)染步驟轉(zhuǎn)染Hacat細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR、Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞VDR基因、蛋白表達(dá)量,篩選出優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定VDR-/-Hacat細(xì)胞株。3.對(duì)照質(zhì)粒及VDR775質(zhì)粒對(duì)Hacat細(xì)胞的影響分組:空白組(BG)、模型組(MG)、對(duì)照質(zhì)粒+模型組(NC-MG)、VDR775質(zhì)粒+模型組(si-MG),ELISA法檢測(cè)各組培養(yǎng)細(xì)胞模型構(gòu)建及驗(yàn)證上清細(xì)胞因子濃度,RT-PCR、Western Blot法檢測(cè)各組VDR、NF-κB、Iκ B基因、蛋白表達(dá)量。4.銀屑Ⅰ號(hào)含藥血清對(duì)VDR沉默前后Hacat細(xì)胞的影響分組:對(duì)照質(zhì)粒+空白組(NC-BG)、對(duì)照質(zhì)粒+模型組(NC-MG)、對(duì)照質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)低劑量組(NC-LD)、對(duì)照質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)中劑量組(NC-MD)、對(duì)照質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)高劑量組(NC-HD)、VDR775質(zhì)粒+空白組(si-BG)、VDR775質(zhì)粒+模型組(si-MD)、VDR775質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)低劑量組(si-LD)、VDR775質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)中劑量組(si-MD)、VDR775質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)高劑量組(si-HD),常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)24h,ELISA法檢測(cè)各組培養(yǎng)上清細(xì)胞因子濃度,RT-PCR、Western Blot法檢測(cè)各組VDR、NF-κB、IκB基因、蛋白表達(dá)量。結(jié)果:臨床研究部分1.銀屑病皮損組織VDR、IκB蛋白表達(dá)明顯低于正常組織(P0.01),NF-κB蛋白表達(dá)明顯高于正常組織(P0.01);且VDR蛋白表達(dá)量與PASI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.474,P=0.000),NF-κB、IκB 表達(dá)量與 PASI 呈正相關(guān)(r=0.093,P=0.325;r=0.037,P=0.713)。2.血熱組NF-κ B表達(dá)量明顯高于血虛組、血瘀組;血瘀組VDR表達(dá)明顯高于血熱組、血虛組,NF-κB、IκB表達(dá)明顯低于血熱組、血虛組;血虛組VDR表達(dá)量明顯低于血熱組、血瘀組。實(shí)驗(yàn)研究部分1.銀屑I號(hào)含藥血清對(duì)銀屑病細(xì)胞模型的影響與 BG 組比較,MG 組 25HVD3 水平顯著降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22水平顯著升高(P0.01);VDR、IκB蛋白及基因表達(dá)水平明顯降低(P0.01),NF-κB蛋白及基因表達(dá)水平明顯升高(P0.01)。與MG組比較,LD、MD、HD組25HVD3水平顯著升高(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-22水平顯著降低(P0.01),MD、HD組IL-17顯著降低(P0.01);LD、MD、HD組VDR、I κ B蛋白表達(dá)均明顯升高(P0.05),NF-κ B蛋白表達(dá)明顯降低(P0.01);MD、HD組VDRmRNA表達(dá)水平均明顯升高(P0.05),MD、HD 組 NF-κ B mRNA 表達(dá)水平明顯降低(P0.05),LD、MD、HD 組 I κ BmRNA 表達(dá)水平均明顯升高(P0.05)。2.VDR-/-細(xì)胞模型構(gòu)建及驗(yàn)證采用VDR775質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí),VDR基因、蛋白表達(dá)水平均低于其他質(zhì)粒;MOI=100時(shí),VDR775質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率最高,MOI=300時(shí),VDRNC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率最高。3.對(duì)照質(zhì)粒及VDR775質(zhì)粒對(duì)Hacat細(xì)胞的影響與 BG 組比較,MG 組 25HVD3 水平顯著降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22水平顯著升高(P0.01);NF-κ B、I κ B蛋白及基因表達(dá)水平明顯升高(P0.01)。與MG組比較,NC-MG組VDR、I κ B、NF-κ B蛋白及基因表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P0.05),細(xì)胞因子表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P0.05);與NC-MG組比較,si-MG組25HVD3水平顯著降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22 水平顯著升高(P0.01),VDR、IκB蛋白表達(dá)明顯降低(P0.01),VDR mRNA表達(dá)明顯降低(P0.01),NF-κB蛋白、基因表達(dá)明顯升高(P0.01)。4.銀屑I號(hào)含藥血清對(duì)VDR沉默前后Hacat細(xì)胞的影響①銀屑I號(hào)含藥血清對(duì)對(duì)照質(zhì)粒干預(yù)Hacat的影響與NC-BG組比較,NC-MG組25HVD3 水平顯著降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 水平顯著升高(P0.01),VDR、IκB蛋白及基因表達(dá)水平均明顯降低(P0.01),NF-κB蛋白、基因表達(dá)水平明顯升高(P0.01)。與NC-MG組比較,NC-LD組INF-γ、IL-1、IL-4顯著降低(P0.05),NF-κB顯著降低(P0.01),IκB明顯升高(P0.01);NC-MD組 25HVD3 明顯升高(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17 水平顯著降低(P0.01),VDR、IκB蛋白及基因表達(dá)顯著升高(P0.05),NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低(P0.05);NC-HD 組 25HVD3 明顯升高(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17 水平顯著降低(P0.01),VDR、IκB蛋白及基因表達(dá)顯著升高(P0.01),NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低(P0.05)。②銀屑I號(hào)含藥血清對(duì)WDR沉默前后Hacat的影響與si-BG組比較,si-MG組 25HVD3 明顯降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 明顯升高(P0.01),VDR、Iκ B蛋白及基因表達(dá)顯著升高(P0.01),NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低(P0.01)。與 si-MG 組比較,si-LD 組 25HVD3 明顯升高(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17明顯降低(P0.05),VDR蛋白及基因顯著升高(P0.05),NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低(P0.05);si-MD組25HVD3明顯升高(P0.01),INF-γ、IL-4、IL-17、IL-22顯著降低(P0.05),VDR、IκB蛋白表達(dá)顯著升高(P0.05),NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低(P0.01),IκBmRNA表達(dá)顯著升高(P0.01);si-HD組25HVD3 明顯升高(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 顯著降低(P0.05),VDR蛋白及基因表達(dá)顯著升高(P0.01),NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低(P0.01),I κ BmRNA 顯著升高(P0.01)。③銀屑Ⅰ號(hào)含藥血清對(duì)VDR沉默前后Hacat細(xì)胞的影響與對(duì)應(yīng)NC組比較,si-BG組 INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 顯著升高(P0.01),VDR 蛋白、基因表達(dá)降低(P0.01);si-MG 組 25HVD3 明顯降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22顯著升高(P0.01),VDR蛋白、基因表達(dá)降低(P0.05),NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著升高(P0.05);si-LD 組 25HVD3 明顯降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22顯著升高(p0.05),VDR蛋白、基因表達(dá)降低(P0.01),NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著升高(P0.05),I κ B蛋白顯著升高(P0.01);si-MD組25HVD3明顯降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22 顯著升高(P0.05),VDR 蛋白、基因表達(dá)降低(P0.05),NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著升高(P0.01);si-HD組25HVD3明顯降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 顯著升高(P0.05),VDR 蛋白、基因表達(dá)降低(P0.01),NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著升高(P0.01);IκBmRNA蛋白顯著降低(P0.01)。結(jié)論:1.尋常型銀屑病皮損中VDR、IκB表達(dá)量低于正常人,NF-κB高于正常人,且蛋白表達(dá)與中醫(yī)辨證分型存在相關(guān)性,VDR信號(hào)抑制可能是銀屑病發(fā)生、發(fā)展的重要原因,蛋白差異表達(dá)可為臨床辨證及用藥提供參考依據(jù)。2.銀屑I號(hào)可促進(jìn)生化因子25HVD3表達(dá),抑制炎癥因子INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22濃度水平,其作用機(jī)制可能與調(diào)控VDR信號(hào)、NF-κ B信號(hào)表達(dá)水平有關(guān)。3.VDR775質(zhì)粒可成功轉(zhuǎn)染Hacat細(xì)胞,顯著抑制VDR蛋白、基因表達(dá)水平,VDR NC質(zhì)粒對(duì)銀屑病細(xì)胞模型生化功能無(wú)顯著影響。4.成功構(gòu)建野生型VDR-/-銀屑病細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)VDR沉默后NF-κ B信號(hào)表達(dá)明顯升高,并且其下游炎癥因子表達(dá)明顯升高,VDR與NF-κB之間可能存在"串話作用",VDR可能通過(guò)調(diào)控NF-κ B表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)。5.銀屑Ⅰ號(hào)可促進(jìn)生化因子表達(dá),降低炎癥因子水平,但與沉默前組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)其抗炎作用明顯減弱,表明VDR可能是銀屑Ⅰ號(hào)調(diào)控NF-κ B信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R758.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1352095