本文關(guān)鍵詞：E3泛素連接酶RNF2在Ⅰ型干擾素抗病毒天然免疫反應(yīng)中的調(diào)控功能及其機(jī)制研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：天然免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)是機(jī)體抵抗病毒侵襲的第一道防線�？共《咎烊幻庖叻磻�(yīng)的不足或過(guò)強(qiáng),都會(huì)導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生,因此對(duì)抗病毒天然免疫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制研究具有重要的意義。翻譯后修飾(Post-translational modification,PTM)在抗病毒天然免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用,其中由E3泛素連接酶介導(dǎo)的泛素化修飾是必不可少的一種,但是含有RING結(jié)構(gòu)域的E3家族(RING E3s)在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的功能還沒(méi)有被完全解析。Ⅰ型干擾素(Type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ)信號(hào)通路的激活是抗病毒天然免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié),由轉(zhuǎn)錄因子 STAT1(Signal transducer and activator of transcription 1)介導(dǎo)產(chǎn)生的一系列干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)則最終決定了抗病毒反應(yīng)的效應(yīng)。然而,過(guò)度激活的IFN-Ⅰ/STAT1信號(hào)不僅不能夠維持抗病毒效應(yīng),還會(huì)引起免疫系統(tǒng)的抑制,導(dǎo)致慢性的病毒感染。因此,對(duì)IFN-Ⅰ/STAT1信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控機(jī)制研究對(duì)于IFN-Ⅰ的臨床應(yīng)用具有重要的價(jià)值。為尋找抗病毒天然免疫反應(yīng)新的調(diào)控分子,解析RING E3家族在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的作用及機(jī)制,我們對(duì)小鼠的115個(gè)RING E3基因進(jìn)行了以siRNAs(Small interfering RNAs)干擾為基礎(chǔ)的高內(nèi)涵篩選。通過(guò)與對(duì)照干擾的結(jié)果相比較,我們共鑒定到9個(gè)正向的調(diào)控分子及30個(gè)負(fù)向調(diào)控分子。為進(jìn)一步尋找IFN-Ⅰ/STAT1信號(hào)的新的負(fù)向調(diào)控分子,我們對(duì)篩選到的30個(gè)負(fù)向調(diào)控分子進(jìn)行了第二輪篩選。通過(guò)外源加入IFN-β后,我們發(fā)現(xiàn)有9個(gè)分子仍然表現(xiàn)出負(fù)向調(diào)控的作用,說(shuō)明這9個(gè)分子主要通過(guò)對(duì)IFN-Ⅰ/STAT1信號(hào)的負(fù)向調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)抗病毒天然免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控。在這9個(gè)分子中,我們選取了具有顯著效應(yīng)的ring finger protein 2(RNF2)進(jìn)行了詳細(xì)的功能和機(jī)制研究。通過(guò)體外干擾,細(xì)胞和小鼠水平的基因敲除,細(xì)胞水平的過(guò)表達(dá)等一系列試驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)RNF2無(wú)論是體外還是體內(nèi),均能夠負(fù)向調(diào)控VSV或IFN-Ⅰ刺激的ISGs的表達(dá),從而抑制細(xì)胞和小鼠對(duì)病毒的抵抗能力。通過(guò)相互作用質(zhì)譜及泛素化修飾定量質(zhì)譜,我們鑒定了 15個(gè)RNF2在抗病毒反應(yīng)中的潛在底物,其中包括轉(zhuǎn)錄因子STAT1,同時(shí)我們還鑒定到了 STAT1上可能受RNF2調(diào)控的12個(gè)潛在賴氨酸位點(diǎn)。通過(guò)免疫沉淀和體外GST pull down的方法,我們證明了RNF2與STAT1的直接相互作用,并且通過(guò)轉(zhuǎn)染一系列的RNF2或STAT1截短體,泛素分子突變體后進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)RNF2主要通過(guò)其RING結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)IFN-Ⅰ刺激下STAT1的K33位連接的多聚泛素化修飾,并抑制了 STAT1介導(dǎo)的啟動(dòng)子序列ISRE的轉(zhuǎn)錄活性。在機(jī)制的研究中,我們利用染色質(zhì)免疫沉淀,體外的DNA pull down等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RNF2并不影響IFN-Ⅰ/STAT1信號(hào)通路的激活,而是通過(guò)修飾STAT1的DNA結(jié)合區(qū)域的K379位點(diǎn)促進(jìn)STAT1與DNA的解離,間接促進(jìn)其發(fā)生去磷酸化反應(yīng),從而及時(shí)抑制IFN-Ⅰ/STAT1信號(hào)。我們的研究不僅系統(tǒng)性地解析了 RING E3分子在抗病毒天然免疫領(lǐng)域內(nèi)的調(diào)控功能,還發(fā)現(xiàn)了一系列抗病毒天然免疫反應(yīng)的新的調(diào)控分子,更為IFN-Ⅰ/STAT1信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控提供了新的機(jī)制。因此,我們的研究結(jié)果具有臨床指導(dǎo)和轉(zhuǎn)化價(jià)值,不僅為治療病毒感染提供了新的潛在靶點(diǎn)和思路,為新的抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ),也為增強(qiáng)IFN-Ⅰ的治療效果,防止IFN-Ⅰ過(guò)度活化或長(zhǎng)期應(yīng)用造成的免疫耐受、免疫抑制甚至免疫損傷提供了新的理論依據(jù)和診斷治療靶標(biāo)。
[Abstract]:The antiviral reaction mediated by the natural immune system is the first line of defense against the invasion of the virus. Inadequate or excessive antiviral innate immune responses can lead to the occurrence of related diseases. Therefore, the research on the regulation mechanism of the natural immune response against viruses is of great significance. Post translational modifications (Post-translational modification, PTM) play an important role in antiviral innate immune responses, including ubiquitination mediated by the E3 ubiquitin ligase is an essential, but the RING domain containing E3 (RING E3s) family in the anti viral innate immune response function has not been fully resolved. Type I interferon (Type 1 interferon IFN- 1) signal pathway is a central link of antiviral innate immune response, the transcription factor STAT1 (Signal transducer and activator of transcription 1) a series of IFN mediated stimulation by gene (Interferon-stimulated genes ISGs) effect is the final decision of the antiviral response. However, the excessively activated IFN- I /STAT1 signal not only does not maintain the antiviral effect, but also causes the suppression of the immune system, resulting in chronic viral infection. Therefore, the study of the negative regulation mechanism of IFN- I /STAT1 signaling pathway is of great value for the clinical application of IFN- I. In order to find new regulatory molecules for the antiviral innate immune response, we analyzed the function and mechanism of RING E3 family in the antiviral innate immune response. We carried out a high content screening based on siRNAs (Small interfering RNAs) interference to 115 RING E3 genes in mice. By comparing with the results of control interference, we have identified 9 positive regulators and 30 negative regulators. In order to further search for new negative regulator molecules of IFN- I /STAT1 signal, we screened 30 negative regulator molecules by second rounds. After exogenous IFN- beta addition, we found that 9 molecules still showed negative regulation role, indicating that these 9 molecules were mainly through negative regulation of IFN- I /STAT1 signal to achieve negative regulation of the innate immune response against virus. In these 9 molecules, we have selected the ring finger protein 2 (RNF2) with significant effects to carry out a detailed study of the functions and mechanisms. Through in vitro interference, cells and mouse levels of gene knockout, cell level expression and a series of experiments, we found that RNF2 both in vitro and in vivo, can negatively regulate the expression of VSV or IFN- 1 stimulation ISGs, thereby inhibiting cell and mice resistance to virus. Through interaction mass spectrometry and ubiquitination modified mass spectrometry, we identified 15 potential substrates for RNF2 in the antiviral response, including transcription factor STAT1. Meanwhile, we identified 12 potential lysine sites that might be regulated by RNF2 on STAT1. By the method of immunoprecipitation and in vitro GST pull down, we demonstrate that the direct interaction between RNF2 and STAT1, and through a series of RNF2 or STAT1 transfected with truncated mutant ubiquitin molecules, after immunoprecipitation experiments, we found that RNF2 mainly through its RING domain by STAT1 K33 under the stimulation of IFN- I connect poly ubiquitination, and inhibits the transcriptional activity of the promoter sequence of STAT1 mediated ISRE. In the mechanism study, we used chromatin immunoprecipitation, DNA pull down in vitro found that RNF2 did not affect the activation of the IFN- of the /STAT1 signaling pathway, but dissociation by modifying the STAT1 DNA binding sites of STAT1 and K379 to promote DNA, indirectly promote the phosphorylation reaction to occur, thereby inhibiting IFN- I /STAT1 the signal in time. Our research not only systematically analyzed the regulatory function of RING E3 molecule in the field of antiviral innate immunity, but also discovered a series of new regulatory molecules of natural immune response to antiviral, which provided a new mechanism for the negative regulation of IFN- I /STAT1 signaling pathway. Therefore, our results have clinical guidance and value transformation, not only provides a new potential target and ideas for the treatment of viral infections, which laid a theoretical foundation for the development of new antiviral drugs, but also to enhance the therapeutic effect of IFN- I, IFN- I prevent the excessive activation caused by long-term application of immune tolerance, immune suppression even the immune injury provides a theoretical basis and a new target for diagnosis and treatment.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1345316