發(fā)布時(shí)間：2017-12-26 21:00

  本文關(guān)鍵詞：可視化LAMP法等溫快速檢測病原菌與恒溫紙質(zhì)微流體芯片構(gòu)建的研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景:病原菌的快速檢測和準(zhǔn)確鑒定在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測,生物戰(zhàn),食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測中是非常重要的。傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定微生物學(xué)方法包括選擇性培養(yǎng),生物化學(xué)和血清特性檢測等。這些傳統(tǒng)的方法幾乎完全依賴于使用特定的瓊脂培養(yǎng)基分離和挑選活的病原細(xì)菌。在實(shí)驗(yàn)室中最常用的鑒定方法是培養(yǎng),進(jìn)而基于微生物的表型和生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的鑒定。然而,這些用于細(xì)菌分析的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)需要幾天或幾周才能提供準(zhǔn)確的結(jié)果。事實(shí)上,在過去的幾十年里,許多快速的方法被開發(fā)來減少檢測時(shí)間。到目前為止,快速的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),側(cè)流免疫測定法和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等,其檢測時(shí)間可以減少到10 24 h和4 6 h,靈敏度可以達(dá)到102-106 cfu/ml。然而,這些測試需要成本較高的儀器和熟練的專業(yè)操作人員,進(jìn)而限制了其廣泛應(yīng)用,特別是在發(fā)展中國家和地區(qū)。在現(xiàn)場檢測(Point-of-Care Test,POCT)及基層普及使用中它們不是最優(yōu)的選擇。因此發(fā)展使用一種快速、簡單和高特異性的檢測新技術(shù)對(duì)于病原微生物的檢測診斷具有重要的臨床意義。核酸的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要特點(diǎn)是核酸擴(kuò)增從開始到結(jié)束都是在一個(gè)恒定的溫度下進(jìn)行。與普通PCR相比,它降低了溫控設(shè)備的成本,只需要一個(gè)普通的恒溫裝置,同時(shí)也減少了反應(yīng)的步驟和時(shí)間。因此在POCT診斷中,核酸恒溫?cái)U(kuò)增比普通PCR更適合。在當(dāng)前核酸的等溫?cái)U(kuò)增方法中,環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法是一種結(jié)果較穩(wěn)定的方法,利用一種Bst DNA聚合酶和特異引物在溫度不變(65℃左右)和較短時(shí)間(30-60min)的條件下即可對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增,并且擁有較高的靈敏性和特異性。此外,它只需要一個(gè)恒溫裝置,從而使檢測的費(fèi)用明顯減少。所以,本課題使用LAMP技術(shù)構(gòu)建一種簡單、快速的病原菌核酸檢測法。早在1990年,Manz A和Widmer團(tuán)隊(duì)首次指出在一塊以平方厘米為單位的小芯片上進(jìn)行樣品制備、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測分析的微流體芯片技術(shù)。其擁有高效率、低損耗(包括檢測用時(shí)、標(biāo)本量、試劑量),分析微型化和高通量化等特點(diǎn),并且通過結(jié)合傳感或樣品前處理模塊,為以后的現(xiàn)場檢測帶來了方便。紙質(zhì)材料,有著來源豐富、價(jià)格低廉、可循環(huán)、不易變性、易處理、易運(yùn)送、易化學(xué)修飾、以及與生物具有較好的相容性等特點(diǎn),和現(xiàn)代印刷技術(shù)相結(jié)合可以制備出集分離、分析和檢測一體的微流體裝置。然而目前市場上的紙質(zhì)微流體芯片主要用來檢測免疫蛋白而在核酸檢測上使用較少。其可能的原因是由于核酸普通PCR擴(kuò)增需要循環(huán)的變化溫度,因而在紙芯片上操作存在一定難度,限制了它的使用。本課題旨在探索在紙質(zhì)微流體芯片上進(jìn)行LAMP等溫?cái)U(kuò)增并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測,提高紙質(zhì)微流體芯片在現(xiàn)場診斷中的使用價(jià)值。目的:本項(xiàng)目擬充分整合LAMP技術(shù)和紙質(zhì)微流體芯片技術(shù)的特色與優(yōu)勢,設(shè)計(jì)和構(gòu)建LAMP-紙質(zhì)微流體芯片,基于LAMP法構(gòu)建一種快速、簡單的病原菌檢測方法,便于現(xiàn)場或野外的早期診斷和早期治療。方法:1.病原微生物及其耐藥基因的可視化LAMP快速檢測的構(gòu)建。1)以銅綠假單胞菌為首的病原微生物收集,并對(duì)亞胺培南耐藥性進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。2)采用簡易水煮法快速提取DNA。3)針對(duì)銅綠假單胞菌的Opr L和Opr D2基因設(shè)計(jì)LAMP引物。4)可視化LAMP反應(yīng)體系的構(gòu)建。5)可視化LAMP檢測的特異性和靈敏性分析。6)臨床標(biāo)本的檢測。7)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Opr D2陰性和陽性菌株與亞胺培南的耐藥性之間的差異。2.用于等溫?cái)U(kuò)增核酸的紙質(zhì)微流體芯片的設(shè)計(jì)和制作。1)在生物活性紙片上對(duì)病原微生物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增檢測。2)用于等溫?cái)U(kuò)增核酸的紙質(zhì)微流體芯片的設(shè)計(jì)。3)選用whatman#1濾紙進(jìn)行紙質(zhì)微流體芯片手工簡易制作。4)使用場發(fā)射掃描電鏡對(duì)制作的紙質(zhì)微流體芯片的微觀結(jié)構(gòu)觀察。3.基于鏈霉親和素-生物素化LAMP體系的構(gòu)建和條件的優(yōu)化。1)基于鏈霉親和素-生物素化LAMP反應(yīng)體系的構(gòu)建:根據(jù)生物素和鏈霉親和素的共價(jià)偶聯(lián)作用,將生物素化的LAMP產(chǎn)物固定在由納米金標(biāo)記鏈霉親和素的紙芯片表面。2)利用熒光定量PCR儀對(duì)其反應(yīng)體系中最佳溫度,時(shí)間,d NTPs濃度,Bst DNA大片段聚合酶濃度,Mg SO4濃度,Betaine濃度以及內(nèi)外引物濃度進(jìn)行選擇和優(yōu)化。3)利用熒光定量PCR儀對(duì)基于鏈霉親和素-生物素化LAMP反應(yīng)的靈敏性和特異性進(jìn)行分析。4)臨床分離株的檢測。結(jié)果:1.成功的簡化了提取病原微生物DNA的操作,縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。并且成功構(gòu)建了一個(gè)快速、靈敏、簡便的檢測耐亞胺培南銅綠假單胞菌的Opr L和Opr D2基因的可視化LAMP法。其特異性好,靈敏度(17.41μg/L)比傳統(tǒng)PCR高10倍。以傳統(tǒng)方法(細(xì)菌培養(yǎng),VITEK 2系統(tǒng),瓊脂稀釋法)為金標(biāo)準(zhǔn),對(duì)臨床標(biāo)本Opr L和Opr D2基因同時(shí)進(jìn)行可視化LAMP法和常規(guī)PCR法檢測。對(duì)Opr L基因,可視化LAMP法檢測的靈敏性和特異性都為100%,普通PCR法分別為94.9%和87%。對(duì)Opr D2基因,可視化LAMP法檢測的靈敏性和特異性分別為75%和737%,普通PCR法分別為70%和73.7%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,Opr D2陽性和Opr D2陰性菌株對(duì)亞胺培南耐藥菌株具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(P0.05)。2.以銅綠假單胞菌為例,成功的在紙片上對(duì)其核酸DNA進(jìn)行了LAMP擴(kuò)增。3.成功的對(duì)核酸等溫?cái)U(kuò)增的紙質(zhì)微流體的設(shè)計(jì)和簡易的制作。獲得國家的實(shí)用新型專利(用于等溫?cái)U(kuò)增核酸的紙質(zhì)微流體,ZL 201420583698.X),國家的發(fā)明專利(一種利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法,201410528335.0)。4.成功的構(gòu)建了基于鏈霉親和素-生物素化LAMP反應(yīng)體系,為下一步在微流體芯片上固定和信號(hào)放大檢測墊定了扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。并對(duì)其LAMP反應(yīng)體系條件進(jìn)行了優(yōu)化:得到最佳反應(yīng)擴(kuò)增的溫度為65℃,反應(yīng)擴(kuò)增時(shí)間為40min,反應(yīng)液中Mg SO4最佳濃度為6 m M,Bst DNA聚合酶濃度為0.32U/μl、d NTPs混合液的工作濃度為1.2m M,b-FIP/BIP內(nèi)引物濃度最佳濃度為1.6μM,F3/B3外引物最佳濃度為0.4μM,Betaine的最佳濃度為0.6m M。以銅綠假單胞菌為例,基于鏈霉親和素-生物化LAMP法使用熒光定量PCR儀檢測分析,其特異性好,靈敏度(0.402μg/L)比可視化LAMP法高100倍,比普通PCR高1000倍。使用該方法檢測銅綠假單胞菌的臨床分離株,其檢出率與可視化LAMP法相當(dāng)(14/14,100%),而常規(guī)PCR法(13/14,93%)。結(jié)論:1.可視化LAMP法用于快速檢測病原微生物及其耐藥基因具有檢測時(shí)間短、過程簡單、靈敏度和特異性高、反應(yīng)結(jié)果肉眼可辨等特點(diǎn)。本課題以銅綠假單胞菌Opr L和Opr D2基因?yàn)槔?成功建立了可視化LAMP檢測技術(shù),使檢測結(jié)果的識(shí)別更容易。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示在亞胺培南耐藥方面,Opr D2陰性菌株具有更高的風(fēng)險(xiǎn)。早期識(shí)別Opr L和Opr D2基因?qū)⒂兄谖覀兏玫貙?duì)IRPA感染選擇抗生素治療方案,這將降低成本和時(shí)間。這種診斷方法更適合用于現(xiàn)場和基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的使用。2.微流體芯片技術(shù)是指在一塊以平方厘米為單位的小芯片上進(jìn)行樣品制備、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測分析的技術(shù)。其擁有高效率、低損耗(包括檢測用時(shí)、標(biāo)本量、試劑量),分析微型化和實(shí)驗(yàn)高通量化等特點(diǎn),并且通過結(jié)合傳感或樣品前處理模塊,為以后的現(xiàn)場檢測帶來了方便。紙作為生物傳感材料有許多優(yōu)勢,它的使用使生物傳感器更加小巧,方便易于攜帶,檢測成本低,是未來生物傳感發(fā)展的趨勢。在本研究中將LAMP技術(shù)與紙質(zhì)微流體芯片技術(shù)進(jìn)行整合,成功設(shè)計(jì)和制作了基于核酸等溫?cái)U(kuò)增的紙質(zhì)微流體芯片,便于下一步在野外或現(xiàn)場對(duì)感染性病原微生物的早期定性或定量檢測。
[Abstract]:Background: rapid detection and accurate identification of pathogenic bacteria are very important in clinical laboratory testing, biological warfare, food industry and environmental monitoring. The traditional microbiological methods for bacterial identification include selective culture, biochemistry and detection of serum characteristics. These traditional methods are almost entirely dependent on the isolation and selection of living pathogenic bacteria using a specific agar medium. The most commonly used method in the laboratory is to identify the bacteria based on the microbial phenotype and growth medium. However, the cultivation experiments used for bacterial analysis will take days or weeks to provide accurate results. In fact, in the past few decades, many fast methods have been developed to reduce detection time. So far, a rapid detection method of enzyme linked immunosorbent assay (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), lateral flow immunoassay and polymerase chain reaction (polymerase chain reaction, PCR), the detection time can be reduced to 1024 h and 46 h, the sensitivity can reach 102-106 cfu/ml. However, these tests require high cost instruments and skilled professional operators, which, in turn, limit their wide range of applications, especially in developing countries and regions. They are not the best choice in Point-of-Care Test (POCT) and at the grassroots level. Therefore, it is of great significance to develop a rapid, simple and highly specific detection technology for the detection and diagnosis of pathogenic microbes. The main characteristic of nucleic acid constant temperature amplification is that the nucleic acid amplification is carried out at a constant temperature from the beginning to the end. Compared with the ordinary PCR, it reduces the cost of the temperature control equipment, requires only an ordinary thermostat device, and reduces the reaction steps and time. Therefore, in the POCT diagnosis, the nucleic acid constant temperature amplification is more suitable than the common PCR. In the isothermal nucleic acid amplification method, loop mediated isothermal amplification (loop-mediated isothermal, amplification, LAMP) method is a more stable outcome, at constant temperature by using a Bst DNA polymerase and specific primers (65 DEG C) and short time (30-60min) under the condition of objective can be amplified, and have high sensitivity and specificity. In addition, it only needs a thermostat device, so that the cost of detection is significantly reduced. Therefore, this subject uses LAMP technology to construct a simple and rapid detection method for nucleic acid of pathogenic bacteria. As early as 1990, Manz A and Widmer team first pointed out that microfluidic chip technology is applied to sample preparation, biochemical reaction and result detection and Analysis on a small chip with square centimeters. It has the characteristics of high efficiency and low loss (including detection time, quantity of samples, reagent quantity), analysis of miniaturization and high-throughput quantification, etc., and combined with sensor or sample pre-processing module, it brings convenience for future field detection. The paper material, has a rich source, low price, can be recycled, not easydenatured, easy processing, easy to transport, easy chemical modification, and biological compatibility is good, and the combination of modern printing technology can be prepared by microfluidic device in isolation, analysis and detection of development. However, the current market paper microfluidic chips are mainly used to detect immune proteins and are less used in nucleic acid detection. The possible reason is that the common PCR amplification of nucleic acids requires a cyclic change in temperature, so it is difficult to operate on the paper chip, which limits its use. The purpose of this study is to explore the LAMP isothermal amplification on paper microfluidic chips and detect the amplified products, so as to improve the application value of paper microfluidic chips in field diagnosis. Objective: this project aims to fully integrate the characteristics and advantages of LAMP technology and paper-based microfluidic chip technology, the design and construction of LAMP- paper microfluidic chip, establish a rapid and simple method for pathogen detection based on LAMP method, to facilitate on-site or field early diagnosis and early treatment. Methods: 1. the construction of visual LAMP for the rapid detection of pathogenic microbes and their resistance genes. 1) the pathogenic microorganism, headed by Pseudomonas aeruginosa, was collected and the drug sensitivity test was carried out on imipenem resistance. 2) quick extraction of DNA by simple boiling method. 3) the LAMP primers were designed for the Opr L and Opr D2 genes of Pseudomonas aeruginosa. 4) the construction of visual LAMP reaction system. 5) the specificity and sensitivity analysis of visual LAMP detection. 6) detection of clinical specimens. 7) statistical analysis of the differences between Opr D2 negative and positive strains and imipenem resistance. 2. the design and production of a paper microchip for isothermal amplification of nucleic acid. 1) LAMP amplification of pathogenic microbes on bioactive paper. 2) the design of a paper microfluidic chip for isothermal amplification of nucleic acids. 3) the whatman#1 filter paper is used to make the paper microfluidic chip handmade and easy to make. 4) the microstructure of a paper microchip produced by field emission scanning electron microscopy (SEM) was observed. 3. the construction and optimization of the LAMP system based on streptomycin biotinylated. 1) based on the construction of streptavidin biotinylated LAMP reaction system, based on the covalent coupling of biotin and streptavidin, the biotinylated LAMP product was immobilized on the surface of the gold chip labeled with streptavidin. 2) fluorescent quantitative PCR was used to select and optimize the best temperature, time, D NTPs concentration, Bst DNA large fragment polymerase concentration, Mg SO4 concentration, Betaine concentration and the concentration of internal and external primers in the reaction system. 3) the sensitivity and specificity of the streptomycin - biotinylated LAMP reaction were analyzed by the fluorescence quantitative PCR instrument. 4) detection of clinical isolates. Results: 1. successfully simplified the operation of extracting pathogenic microorganism DNA and shortened the experiment time. And successful construction
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R446.5

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本文編號(hào)：1338810