本文關鍵詞：鋸葉棕提取物治療雄激素性禿發(fā)實驗及機制的初步研究　出處：《南京中醫(yī)藥大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：雄激素性禿發(fā)(Androgenic alopecia,AGA),又稱脂溢性脫發(fā)、男性型脫發(fā),屬中醫(yī)學"發(fā)蛀脫發(fā)"、"蛀發(fā)癬"范疇,是皮膚科臨床的常見病、多發(fā)病,也是難治性疾病之一,該病病程漫長且頑固難愈。目前AGA的病因及發(fā)病機制尚不明確,一般認為雄激素及其受體的表達在本病的發(fā)生中起關鍵作用,而Ⅱ型5α-還原酶是其發(fā)病的重要因素。研究認為,雄激素(睪酮)在Ⅱ型5α-還原酶作用下轉化為活性更強的雙氫睪酮(Dihydrotestosterone,DHT),雙氫睪酮與其受體結合后進一步誘導TGF-β2表達,TGF-β2是毛發(fā)生長的負調控因子,可導致毛發(fā)生長期縮短,提前進入休止期,從而引起脫發(fā)。此外,TGF-β2還能夠促進caspase3和caspase9的表達,影響B(tài)cl-2/Bax比率,引起細胞(如毛乳頭細胞)線粒體凋亡。目前國內(nèi)經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準的用于治療男性AGA的口服藥物主要是非那雄胺片。該藥雖廣泛應用于臨床,但不能完全阻斷病程進展,且存在不同程度的不良反應。鋸葉棕(Sawpalmetto),又名沙巴棕,是生長于美國東南部一種常見的棕櫚科灌木,其果實提取物富含油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、亞油酸等,是目前廣泛應用于治療前列腺增生的天然植物制劑�，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),鋸葉棕果實提取物(Sawpalmetto extracts,SPE)具有非競爭性抑制5α-還原酶活性(Ⅰ型和Ⅱ型)、抑制雙氫睪酮與其受體結合、抗炎及抗凋亡等藥理作用,而其是否具有促毛發(fā)生長的作用尚未見報道�；贏GA與前列腺增生的發(fā)病均與雄激素和ⅡⅡ型5α-還原酶相關,本研究以非那雄胺作參比,觀察鋸葉棕果實提取物對人角質形成細胞和人毛乳頭細胞存活的影響,同時構建雄激素性禿發(fā)小鼠模型,探索其是否具有促毛發(fā)生長作用,并初步探討其相應的機制。研究內(nèi)容:1.觀察鋸葉棕果實提取物對人角質形成細胞(human keratinocytes,HaCaTs)及人毛乳頭細胞(human hair dermal papilla cells,HHDPCs)增殖的影響以及量效關系;2.建立雄激素性禿發(fā)小鼠模型,并進行分組實驗處理,觀察鋸葉棕果實提取物對小鼠毛發(fā)的促生長作用并初步探討其機制。研究方法:1.細胞實驗:常規(guī)培養(yǎng)HaCaTs和HHDPCs細胞,并進行分組給藥:空白組:正常培養(yǎng)細胞,不予處理;雙氫睪酮(DHT)組:加入0.03μg/mLDHT培養(yǎng)液;DHT+非那雄胺組:加入0.03μg/mL DHT + 0.08μg/mL非那雄胺培養(yǎng)液;DHT+SPE組:加入0.03μg/mL DHT +(1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)SPE 培養(yǎng)液。用 MTT法檢測各組細胞增殖率。2.動物實驗:2.1建立C57BL/6小鼠雄激素性禿發(fā)的動物模型,并隨機分為四組,每組8只:空白對照組、雙氫睪酮(DHT)組、DHT+非那雄胺組、DHT+SPE組;觀察各組小鼠灌服給藥后各個時期(第7、14、21、28、35天)毛發(fā)的生長情況并記錄評分;2.2給藥35天后,脫頸處死小鼠,取其背部脫毛區(qū)圓形皮片,手術刀刮取皮片上所有毛發(fā)并稱重,記錄各組小鼠毛發(fā)質量;2.3取部分圓形皮片進一步做組織切片,HE染色,計算各組生長期(A)、退行期(T)毛囊數(shù)量;2.4采用Western blot法分別檢測四組圓形皮片組織中TGF-β2、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3蛋白的表達量。研究結果:1.DHT對HaCaTs細胞增殖的影響:DHT能夠誘導HaCaTs凋亡,且隨著培養(yǎng)時間的延長而增強。SPE和非那雄胺均能夠抑制DHT誘導的HaCaTs凋亡,并促進其增殖。其中SPE呈濃度依賴性和時間依賴性,隨著給藥濃度的增加(≤1O0μg/mL)和培養(yǎng)時間的延長,其促進作用逐漸增強,在25μg/mL濃度時,開始優(yōu)于非那雄胺,在1000μg/mL濃度時達到最強;而當SPE達到200μg/mL時,其促進HaCaTs增殖作用隨著時間的延長而減弱。各實驗組間存在統(tǒng)計學差異。2.DHT對HHDPCs細胞增殖的影響:DHT能夠誘導HHDPCs凋亡,且隨著培養(yǎng)時間的延長而增強。SPE和非那雄胺均能夠抑制DHT誘導的HHDPCs凋亡,并促進其增殖。SPE在低濃度時(1μg/mL、5μg/mL)即表現(xiàn)出較強的促增殖作用,且均優(yōu)于非那雄胺,差異有統(tǒng)計學意義。當濃度≥25μg/mL時,其促增殖作用逐漸減弱。3.C57BL/6小鼠雄激素性禿發(fā)模型的建立:C57BL/6小鼠脫毛區(qū)皮膚均呈現(xiàn)粉紅色,毛發(fā)生長處于休止期,說明成功建立了 C57BL/6小鼠禿發(fā)模型。4.SPE對小鼠毛發(fā)生長的影響:空白對照組、非那雄胺組、SPE組小鼠在28天、35天毛發(fā)生長情況評分結果一致,但總的來說,空白對照組小鼠毛發(fā)生長相對最好,背部皮膚最早出現(xiàn)黑色(7天內(nèi)),非那雄胺組次之(14天內(nèi)),SPE組相對較差,皮膚出現(xiàn)黑色較晚(21天內(nèi))。而DHT組35天內(nèi)未見新生毛發(fā)長出。毛發(fā)稱重結果中,空白組和非那雄胺組接近,分別為41.38g和40.8g,SPE組17.95g,DHT組為0。取背部圓形皮片HE染色100X下毛囊計數(shù)發(fā)現(xiàn),非那雄胺組和SPE組毛囊總數(shù)接近,分別為68和65,均明顯高于空白組(48)和DHT組(33)。SPE組處于生長期毛囊計數(shù)與非那雄胺組接近,視野下各組毛囊分布較均勻。5.SPE 對 TGF-β2、cleaved caspase3、Bax、Bcl-2 的影響:Western blot 結果顯示,細胞凋亡因子TGF-β2、cleaved caspase3、Bax在DHT組的表達量明顯高于其它三組,依次是DHT組SPE組非那雄胺組空白組;而細胞凋亡抑制因子Bcl-2的表達正好相反,在空白組最高,依次為空白組非那雄胺組SPE組DHT組。結論:鋸葉棕果實提取物能夠促進毛發(fā)生長。與非那雄胺相比,其促進作用稍弱,起效相對較慢。其機制可能與抑制TGF-β2、cleaved caspase3、Bax,而促進Bcl-2的表達相關。
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R275.9

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本文編號：1332019