發(fā)布時(shí)間：2017-12-25 08:10

  本文關(guān)鍵詞：鋸葉棕提取物治療雄激素性禿發(fā)實(shí)驗(yàn)及機(jī)制的初步研究　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：雄激素性禿發(fā)(Androgenic alopecia,AGA),又稱(chēng)脂溢性脫發(fā)、男性型脫發(fā),屬中醫(yī)學(xué)"發(fā)蛀脫發(fā)"、"蛀發(fā)癬"范疇,是皮膚科臨床的常見(jiàn)病、多發(fā)病,也是難治性疾病之一,該病病程漫長(zhǎng)且頑固難愈。目前AGA的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確,一般認(rèn)為雄激素及其受體的表達(dá)在本病的發(fā)生中起關(guān)鍵作用,而Ⅱ型5α-還原酶是其發(fā)病的重要因素。研究認(rèn)為,雄激素(睪酮)在Ⅱ型5α-還原酶作用下轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的雙氫睪酮(Dihydrotestosterone,DHT),雙氫睪酮與其受體結(jié)合后進(jìn)一步誘導(dǎo)TGF-β2表達(dá),TGF-β2是毛發(fā)生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子,可導(dǎo)致毛發(fā)生長(zhǎng)期縮短,提前進(jìn)入休止期,從而引起脫發(fā)。此外,TGF-β2還能夠促進(jìn)caspase3和caspase9的表達(dá),影響B(tài)cl-2/Bax比率,引起細(xì)胞(如毛乳頭細(xì)胞)線粒體凋亡。目前國(guó)內(nèi)經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準(zhǔn)的用于治療男性AGA的口服藥物主要是非那雄胺片。該藥雖廣泛應(yīng)用于臨床,但不能完全阻斷病程進(jìn)展,且存在不同程度的不良反應(yīng)。鋸葉棕(Sawpalmetto),又名沙巴棕,是生長(zhǎng)于美國(guó)東南部一種常見(jiàn)的棕櫚科灌木,其果實(shí)提取物富含油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、亞油酸等,是目前廣泛應(yīng)用于治療前列腺增生的天然植物制劑。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),鋸葉棕果實(shí)提取物(Sawpalmetto extracts,SPE)具有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制5α-還原酶活性(Ⅰ型和Ⅱ型)、抑制雙氫睪酮與其受體結(jié)合、抗炎及抗凋亡等藥理作用,而其是否具有促毛發(fā)生長(zhǎng)的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。基于AGA與前列腺增生的發(fā)病均與雄激素和ⅡⅡ型5α-還原酶相關(guān),本研究以非那雄胺作參比,觀察鋸葉棕果實(shí)提取物對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞和人毛乳頭細(xì)胞存活的影響,同時(shí)構(gòu)建雄激素性禿發(fā)小鼠模型,探索其是否具有促毛發(fā)生長(zhǎng)作用,并初步探討其相應(yīng)的機(jī)制。研究?jī)?nèi)容:1.觀察鋸葉棕果實(shí)提取物對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞(human keratinocytes,HaCaTs)及人毛乳頭細(xì)胞(human hair dermal papilla cells,HHDPCs)增殖的影響以及量效關(guān)系;2.建立雄激素性禿發(fā)小鼠模型,并進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)處理,觀察鋸葉棕果實(shí)提取物對(duì)小鼠毛發(fā)的促生長(zhǎng)作用并初步探討其機(jī)制。研究方法:1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):常規(guī)培養(yǎng)HaCaTs和HHDPCs細(xì)胞,并進(jìn)行分組給藥:空白組:正常培養(yǎng)細(xì)胞,不予處理;雙氫睪酮(DHT)組:加入0.03μg/mLDHT培養(yǎng)液;DHT+非那雄胺組:加入0.03μg/mL DHT + 0.08μg/mL非那雄胺培養(yǎng)液;DHT+SPE組:加入0.03μg/mL DHT +(1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)SPE 培養(yǎng)液。用 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):2.1建立C57BL/6小鼠雄激素性禿發(fā)的動(dòng)物模型,并隨機(jī)分為四組,每組8只:空白對(duì)照組、雙氫睪酮(DHT)組、DHT+非那雄胺組、DHT+SPE組;觀察各組小鼠灌服給藥后各個(gè)時(shí)期(第7、14、21、28、35天)毛發(fā)的生長(zhǎng)情況并記錄評(píng)分;2.2給藥35天后,脫頸處死小鼠,取其背部脫毛區(qū)圓形皮片,手術(shù)刀刮取皮片上所有毛發(fā)并稱(chēng)重,記錄各組小鼠毛發(fā)質(zhì)量;2.3取部分圓形皮片進(jìn)一步做組織切片,HE染色,計(jì)算各組生長(zhǎng)期(A)、退行期(T)毛囊數(shù)量;2.4采用Western blot法分別檢測(cè)四組圓形皮片組織中TGF-β2、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)量。研究結(jié)果:1.DHT對(duì)HaCaTs細(xì)胞增殖的影響:DHT能夠誘導(dǎo)HaCaTs凋亡,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。SPE和非那雄胺均能夠抑制DHT誘導(dǎo)的HaCaTs凋亡,并促進(jìn)其增殖。其中SPE呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性,隨著給藥濃度的增加(≤1O0μg/mL)和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),其促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng),在25μg/mL濃度時(shí),開(kāi)始優(yōu)于非那雄胺,在1000μg/mL濃度時(shí)達(dá)到最強(qiáng);而當(dāng)SPE達(dá)到200μg/mL時(shí),其促進(jìn)HaCaTs增殖作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱。各實(shí)驗(yàn)組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.DHT對(duì)HHDPCs細(xì)胞增殖的影響:DHT能夠誘導(dǎo)HHDPCs凋亡,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。SPE和非那雄胺均能夠抑制DHT誘導(dǎo)的HHDPCs凋亡,并促進(jìn)其增殖。SPE在低濃度時(shí)(1μg/mL、5μg/mL)即表現(xiàn)出較強(qiáng)的促增殖作用,且均優(yōu)于非那雄胺,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)濃度≥25μg/mL時(shí),其促增殖作用逐漸減弱。3.C57BL/6小鼠雄激素性禿發(fā)模型的建立:C57BL/6小鼠脫毛區(qū)皮膚均呈現(xiàn)粉紅色,毛發(fā)生長(zhǎng)處于休止期,說(shuō)明成功建立了 C57BL/6小鼠禿發(fā)模型。4.SPE對(duì)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的影響:空白對(duì)照組、非那雄胺組、SPE組小鼠在28天、35天毛發(fā)生長(zhǎng)情況評(píng)分結(jié)果一致,但總的來(lái)說(shuō),空白對(duì)照組小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)相對(duì)最好,背部皮膚最早出現(xiàn)黑色(7天內(nèi)),非那雄胺組次之(14天內(nèi)),SPE組相對(duì)較差,皮膚出現(xiàn)黑色較晚(21天內(nèi))。而DHT組35天內(nèi)未見(jiàn)新生毛發(fā)長(zhǎng)出。毛發(fā)稱(chēng)重結(jié)果中,空白組和非那雄胺組接近,分別為41.38g和40.8g,SPE組17.95g,DHT組為0。取背部圓形皮片HE染色100X下毛囊計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),非那雄胺組和SPE組毛囊總數(shù)接近,分別為68和65,均明顯高于空白組(48)和DHT組(33)。SPE組處于生長(zhǎng)期毛囊計(jì)數(shù)與非那雄胺組接近,視野下各組毛囊分布較均勻。5.SPE 對(duì) TGF-β2、cleaved caspase3、Bax、Bcl-2 的影響:Western blot 結(jié)果顯示,細(xì)胞凋亡因子TGF-β2、cleaved caspase3、Bax在DHT組的表達(dá)量明顯高于其它三組,依次是DHT組SPE組非那雄胺組空白組;而細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)正好相反,在空白組最高,依次為空白組非那雄胺組SPE組DHT組。結(jié)論:鋸葉棕果實(shí)提取物能夠促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。與非那雄胺相比,其促進(jìn)作用稍弱,起效相對(duì)較慢。其機(jī)制可能與抑制TGF-β2、cleaved caspase3、Bax,而促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R275.9

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本文編號(hào)：1332019