本文關鍵詞：血管緊張素Ⅱ對多巴胺能神經元凋亡的影響及機制研究　出處：《南京醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：隨著全球人口老齡化進程的加劇,帕金森病(Parkinson's disease,PD)深深影響著全球范圍內老年人的生活質量,同時也造成了巨大的社會經濟負擔。PD最主要的臨床表現(xiàn)是運動遲緩、靜止性震顫、肌強直和姿勢平衡障礙,主要的病理學特點是黑質區(qū)多巴胺能神經元的進行性缺失。目前其發(fā)病機制尚不明確,且缺乏有效的防治手段阻止疾病的進程。近來越來越多的研究發(fā)現(xiàn),PD患者及PD動物模型的腦中,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin-system,RAS)的主要組成部分血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)的含量明顯增高,提示PD的發(fā)病機制與腦內RAS的過度激活密切相關。因此,從生物學層面研究AngⅡ與PD病理進程的關聯(lián),成為了本領域的一個研究熱點。RAS主要負責調節(jié)機體的血壓和水、鹽平衡,維持內環(huán)境的穩(wěn)定。腦中及體內多個組織和器官均存在獨立的RAS系統(tǒng),稱為局部RAS系統(tǒng)。且與循環(huán)系統(tǒng)RAS的主要成分相似,局部RAS也可見Ang Ⅱ及其1型受體(AT1R)和2型受體(AT2R)的穩(wěn)定表達。包括我課題組在內的不少先前實驗已經發(fā)現(xiàn),AngⅡ與帕金森病多巴胺能神經元的損傷緊密相關,且利用血管緊張素轉換酶抑制劑(ACE inhibitors,ACEI)或 Ang Ⅱ 受體拮抗劑(Angiotensin Ⅱ receptor blockers,ARB)阻斷Ang Ⅱ介導的信號通路可減少基底節(jié)區(qū)多巴胺能神經元的凋亡。此外,在諸如心臟、腎臟等組織或器官中,AngⅡ均可通過增強自噬活動以加劇心肌細胞和腎臟足細胞的凋亡,從而加強對心肌和腎臟的損傷,這提示細胞凋亡可能與自噬密不可分。因此,在本研究的第一部分,我們擬利用可以穩(wěn)定表達AT1R和AT2R的Cath.a多巴胺能細胞株作為研究對象,分別觀察Ang Ⅱ對神經元凋亡和自噬的影響以及神經元凋亡和自噬之間的關聯(lián),并進一步觀察何種受體參與了 Ang Ⅱ引起前述效應的過程,從而闡明Ang Ⅱ對離體多巴胺能神經元的影響及相關機制。ARB類藥物已被部分實驗證明對多巴胺能神經元具有保護作用,而目前關于ARB類藥物對PD動物模型病理學及行為學的影響及分子機制的研究較少。因此,在本研究的第二部分,我們首先利用魚藤酮構建PD大鼠模型,觀察黑質區(qū)AngⅡ和AT1R、AT2R含量的表達變化,以從活體層面初步探尋AngⅡ及其何種受體可能參與PD的病理進程。接著,通過外源性Ang Ⅱ和(或)一種AngⅡ受體拮抗劑氯沙坦連續(xù)一周對大鼠注射給藥,觀察Ang Ⅱ及氯沙坦對正常大鼠黑質區(qū)多巴胺能神經元凋亡的影響。最后,通過對魚藤酮造模成功的PD大鼠進行阿齊沙坦(一種新型AT1受體拮抗劑)灌胃,觀察阿齊沙坦對PD動物模型多巴胺能神經元及其PD癥狀的影響,以明確AT1受體拮抗劑在PD治療中的保護作用。綜上所述,本項目的完成不僅能從離體和活體層面探究Ang Ⅱ對多巴胺能神經元凋亡的影響,更能揭示PD的部分發(fā)病機制,從而為PD的預防與治療提供新的靶點和理論依據。第一部分血管緊張素Ⅱ對多巴胺能神經元細胞株凋亡和自噬的影響及機制研究目的:研究Ang Ⅱ對Cath.a多巴胺能神經元細胞株凋亡和自噬的影響及相關機制。方法:本實驗利用一種可以穩(wěn)定表達AT1R和AT2R的多巴胺能細胞株—Cath.a細胞作為研究對象,(1)研究AngⅡ對細胞凋亡的影響:低、中、高不同濃度的Ang Ⅱ分別處理細胞后,采用蛋白免疫印跡法觀察各組凋亡標志物cleaved caspase-3的蛋白表達,采用caspase 3活性檢測試劑盒檢測各組細胞caspase 3的活性,采用流式細胞儀測量各組細胞的凋亡率;(2)研究Ang Ⅱ對細胞自噬的影響:低、中、高不同濃度的Ang Ⅱ處理細胞后,采用蛋白免疫印跡法觀察各組自噬標志物LC3-Ⅱ和p62的蛋白含量,采用免疫熒光法比較各組細胞LC3-Ⅱ的表達;(3)研究細胞凋亡和自噬間的關聯(lián):利用自噬抑制劑3-MA阻斷Ang Ⅱ對細胞自噬的激活,觀察自噬被抑制后,Ang Ⅱ對細胞凋亡標志物cleaved caspase-3及caspase 3活性的變化;(4)研究何種受體參與了 Ang Ⅱ的前述作用:利用AT1受體拮抗劑氯沙坦和AT2受體拮抗劑PD123319分別干預Ang Ⅱ介導的信號通路,觀察AT1R和AT2R被阻斷后,Ang Ⅱ對細胞凋亡標志物cleaved caspase-3、caspase 3活性以及自噬標志物LC3-Ⅱ和p62的變化。結果:與對照組相比,中、高濃度Ang Ⅱ可以明顯增加Cath.a細胞cleaved caspase-3的蛋白表達、caspase 3活性及細胞凋亡率;與對照組相比,中、高濃度Ang Ⅱ可以顯著增加Cath.a細胞LC3-Ⅱ的蛋白含量、降低p62的蛋白含量、增強LC3-Ⅱ在細胞的表達;自噬抑制劑3-MA可以完全阻斷Ang Ⅱ對細胞自噬的激活,與此同時,Ang Ⅱ對細胞的凋亡作用也被完全抑制;AT1受體拮抗劑氯沙坦給藥后,Ang Ⅱ對細胞的自噬和凋亡作用被完全逆轉,而AT2受體拮抗劑PD123319對此并無顯著影響。結論:(1)Ang Ⅱ可以增加多巴胺能神經元的凋亡和自噬活動;(2)AngⅡ對細胞凋亡的增強作用可通過激活自噬實現(xiàn);(3)AT1受體而非AT2受體參與AngⅡ對細胞的上述作用。第二部分 血管緊張素Ⅱ對帕金森病大鼠病理學及行為學的影響及機制研究目的:研究Ang Ⅱ對PD大鼠模型黑質區(qū)多巴胺能神經元的凋亡和對其PD癥狀的影響及相關機制。方法:本實驗利用Lewis大鼠作為研究對象,(1)研究PD病理進程是否與RAS的過度激活有關:在魚藤酮成功構建PD大鼠模型后,采用ELISA試劑盒、實時定量PCR法和蛋白免疫印跡技術檢測大鼠黑質區(qū)Ang Ⅱ及其AT1R、AT2R的含量變化;(2)研究外源性Ang Ⅱ對正常大鼠黑質區(qū)多巴胺能神經元凋亡的影響及所依賴的受體:對大鼠右側黑質區(qū)持續(xù)一周直接注射外源性Ang Ⅱ和(或)AT1R拮抗劑氯沙坦,采用免疫組化技術觀察各組大鼠黑質區(qū)TH陽性細胞數(shù),采用caspase-3活性試劑盒比較各組大鼠黑質區(qū)神經元的caspase-3活性;(3)研究新型AT1R拮抗劑阿齊沙坦對PD大鼠黑質區(qū)多巴胺能神經元凋亡和對其PD癥狀的影響:對魚藤酮造模成功的PD大鼠進行阿齊沙坦灌胃,采用免疫組化技術和caspase-3活性試劑盒觀察不同組大鼠黑質區(qū)神經元的凋亡情況,采用垂直網格實驗及水平杠桿實驗對各組大鼠行為學進行檢測。結果:與對照組相比,PD大鼠組黑質區(qū)Ang Ⅱ及AT1R含量明顯升高,而AT2R含量無明顯變化;外源性Ang Ⅱ注射組相較對照組顯著減少大鼠右側黑質區(qū)TH陽性細胞的表達及增高其caspase-3活性,而Ang Ⅱ的上述作用在氯沙坦共同給藥后被完全阻斷;相較PD組,阿齊沙坦灌胃組大鼠黑質區(qū)TH陽性細胞明顯增加、caspase-3活性明顯降低,且大鼠的PD癥狀明顯緩解。結論:(1)在魚藤酮成功構建的PD大鼠模型中,腦內Ang Ⅱ/AT1軸的過度激活參與PD的發(fā)生發(fā)展;(2)—種新型AT1受體拮抗劑阿齊沙坦可以減少PD大鼠黑質區(qū)多巴胺能神經元的凋亡、緩解其PD癥狀,從而在PD的病理進程中起到保護作用。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742.5

【參考文獻】

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本文編號：1328410