發(fā)布時(shí)間：2017-12-24 12:31

  本文關(guān)鍵詞：血管緊張素Ⅱ?qū)Χ喟桶纺苌窠?jīng)元凋亡的影響及機(jī)制研究　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加劇,帕金森病(Parkinson's disease,PD)深深影響著全球范圍內(nèi)老年人的生活質(zhì)量,同時(shí)也造成了巨大的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。PD最主要的臨床表現(xiàn)是運(yùn)動遲緩、靜止性震顫、肌強(qiáng)直和姿勢平衡障礙,主要的病理學(xué)特點(diǎn)是黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性缺失。目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確,且缺乏有效的防治手段阻止疾病的進(jìn)程。近來越來越多的研究發(fā)現(xiàn),PD患者及PD動物模型的腦中,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin-system,RAS)的主要組成部分血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)的含量明顯增高,提示PD的發(fā)病機(jī)制與腦內(nèi)RAS的過度激活密切相關(guān)。因此,從生物學(xué)層面研究AngⅡ與PD病理進(jìn)程的關(guān)聯(lián),成為了本領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。RAS主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)機(jī)體的血壓和水、鹽平衡,維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。腦中及體內(nèi)多個(gè)組織和器官均存在獨(dú)立的RAS系統(tǒng),稱為局部RAS系統(tǒng)。且與循環(huán)系統(tǒng)RAS的主要成分相似,局部RAS也可見Ang Ⅱ及其1型受體(AT1R)和2型受體(AT2R)的穩(wěn)定表達(dá)。包括我課題組在內(nèi)的不少先前實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn),AngⅡ與帕金森病多巴胺能神經(jīng)元的損傷緊密相關(guān),且利用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACE inhibitors,ACEI)或 Ang Ⅱ 受體拮抗劑(Angiotensin Ⅱ receptor blockers,ARB)阻斷Ang Ⅱ介導(dǎo)的信號通路可減少基底節(jié)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。此外,在諸如心臟、腎臟等組織或器官中,AngⅡ均可通過增強(qiáng)自噬活動以加劇心肌細(xì)胞和腎臟足細(xì)胞的凋亡,從而加強(qiáng)對心肌和腎臟的損傷,這提示細(xì)胞凋亡可能與自噬密不可分。因此,在本研究的第一部分,我們擬利用可以穩(wěn)定表達(dá)AT1R和AT2R的Cath.a多巴胺能細(xì)胞株作為研究對象,分別觀察Ang Ⅱ?qū)ι窠?jīng)元凋亡和自噬的影響以及神經(jīng)元凋亡和自噬之間的關(guān)聯(lián),并進(jìn)一步觀察何種受體參與了 Ang Ⅱ引起前述效應(yīng)的過程,從而闡明Ang Ⅱ?qū)﹄x體多巴胺能神經(jīng)元的影響及相關(guān)機(jī)制。ARB類藥物已被部分實(shí)驗(yàn)證明對多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用,而目前關(guān)于ARB類藥物對PD動物模型病理學(xué)及行為學(xué)的影響及分子機(jī)制的研究較少。因此,在本研究的第二部分,我們首先利用魚藤酮構(gòu)建PD大鼠模型,觀察黑質(zhì)區(qū)AngⅡ和AT1R、AT2R含量的表達(dá)變化,以從活體層面初步探尋AngⅡ及其何種受體可能參與PD的病理進(jìn)程。接著,通過外源性Ang Ⅱ和(或)一種AngⅡ受體拮抗劑氯沙坦連續(xù)一周對大鼠注射給藥,觀察Ang Ⅱ及氯沙坦對正常大鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的影響。最后,通過對魚藤酮造模成功的PD大鼠進(jìn)行阿齊沙坦(一種新型AT1受體拮抗劑)灌胃,觀察阿齊沙坦對PD動物模型多巴胺能神經(jīng)元及其PD癥狀的影響,以明確AT1受體拮抗劑在PD治療中的保護(hù)作用。綜上所述,本項(xiàng)目的完成不僅能從離體和活體層面探究Ang Ⅱ?qū)Χ喟桶纺苌窠?jīng)元凋亡的影響,更能揭示PD的部分發(fā)病機(jī)制,從而為PD的預(yù)防與治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。第一部分血管緊張素Ⅱ?qū)Χ喟桶纺苌窠?jīng)元細(xì)胞株凋亡和自噬的影響及機(jī)制研究目的:研究Ang Ⅱ?qū)ath.a多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞株凋亡和自噬的影響及相關(guān)機(jī)制。方法:本實(shí)驗(yàn)利用一種可以穩(wěn)定表達(dá)AT1R和AT2R的多巴胺能細(xì)胞株—Cath.a細(xì)胞作為研究對象,(1)研究AngⅡ?qū)?xì)胞凋亡的影響:低、中、高不同濃度的Ang Ⅱ分別處理細(xì)胞后,采用蛋白免疫印跡法觀察各組凋亡標(biāo)志物cleaved caspase-3的蛋白表達(dá),采用caspase 3活性檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞caspase 3的活性,采用流式細(xì)胞儀測量各組細(xì)胞的凋亡率;(2)研究Ang Ⅱ?qū)?xì)胞自噬的影響:低、中、高不同濃度的Ang Ⅱ處理細(xì)胞后,采用蛋白免疫印跡法觀察各組自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ和p62的蛋白含量,采用免疫熒光法比較各組細(xì)胞LC3-Ⅱ的表達(dá);(3)研究細(xì)胞凋亡和自噬間的關(guān)聯(lián):利用自噬抑制劑3-MA阻斷Ang Ⅱ?qū)?xì)胞自噬的激活,觀察自噬被抑制后,Ang Ⅱ?qū)?xì)胞凋亡標(biāo)志物cleaved caspase-3及caspase 3活性的變化;(4)研究何種受體參與了 Ang Ⅱ的前述作用:利用AT1受體拮抗劑氯沙坦和AT2受體拮抗劑PD123319分別干預(yù)Ang Ⅱ介導(dǎo)的信號通路,觀察AT1R和AT2R被阻斷后,Ang Ⅱ?qū)?xì)胞凋亡標(biāo)志物cleaved caspase-3、caspase 3活性以及自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ和p62的變化。結(jié)果:與對照組相比,中、高濃度Ang Ⅱ可以明顯增加Cath.a細(xì)胞cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)、caspase 3活性及細(xì)胞凋亡率;與對照組相比,中、高濃度Ang Ⅱ可以顯著增加Cath.a細(xì)胞LC3-Ⅱ的蛋白含量、降低p62的蛋白含量、增強(qiáng)LC3-Ⅱ在細(xì)胞的表達(dá);自噬抑制劑3-MA可以完全阻斷Ang Ⅱ?qū)?xì)胞自噬的激活,與此同時(shí),Ang Ⅱ?qū)?xì)胞的凋亡作用也被完全抑制;AT1受體拮抗劑氯沙坦給藥后,Ang Ⅱ?qū)?xì)胞的自噬和凋亡作用被完全逆轉(zhuǎn),而AT2受體拮抗劑PD123319對此并無顯著影響。結(jié)論:(1)Ang Ⅱ可以增加多巴胺能神經(jīng)元的凋亡和自噬活動;(2)AngⅡ?qū)?xì)胞凋亡的增強(qiáng)作用可通過激活自噬實(shí)現(xiàn);(3)AT1受體而非AT2受體參與AngⅡ?qū)?xì)胞的上述作用。第二部分 血管緊張素Ⅱ?qū)ε两鹕〈笫蟛±韺W(xué)及行為學(xué)的影響及機(jī)制研究目的:研究Ang Ⅱ?qū)D大鼠模型黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡和對其PD癥狀的影響及相關(guān)機(jī)制。方法:本實(shí)驗(yàn)利用Lewis大鼠作為研究對象,(1)研究PD病理進(jìn)程是否與RAS的過度激活有關(guān):在魚藤酮成功構(gòu)建PD大鼠模型后,采用ELISA試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR法和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測大鼠黑質(zhì)區(qū)Ang Ⅱ及其AT1R、AT2R的含量變化;(2)研究外源性Ang Ⅱ?qū)φ４笫蠛谫|(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的影響及所依賴的受體:對大鼠右側(cè)黑質(zhì)區(qū)持續(xù)一周直接注射外源性Ang Ⅱ和(或)AT1R拮抗劑氯沙坦,采用免疫組化技術(shù)觀察各組大鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù),采用caspase-3活性試劑盒比較各組大鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的caspase-3活性;(3)研究新型AT1R拮抗劑阿齊沙坦對PD大鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元凋亡和對其PD癥狀的影響:對魚藤酮造模成功的PD大鼠進(jìn)行阿齊沙坦灌胃,采用免疫組化技術(shù)和caspase-3活性試劑盒觀察不同組大鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況,采用垂直網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)及水平杠桿實(shí)驗(yàn)對各組大鼠行為學(xué)進(jìn)行檢測。結(jié)果:與對照組相比,PD大鼠組黑質(zhì)區(qū)Ang Ⅱ及AT1R含量明顯升高,而AT2R含量無明顯變化;外源性Ang Ⅱ注射組相較對照組顯著減少大鼠右側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞的表達(dá)及增高其caspase-3活性,而Ang Ⅱ的上述作用在氯沙坦共同給藥后被完全阻斷;相較PD組,阿齊沙坦灌胃組大鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞明顯增加、caspase-3活性明顯降低,且大鼠的PD癥狀明顯緩解。結(jié)論:(1)在魚藤酮成功構(gòu)建的PD大鼠模型中,腦內(nèi)Ang Ⅱ/AT1軸的過度激活參與PD的發(fā)生發(fā)展;(2)—種新型AT1受體拮抗劑阿齊沙坦可以減少PD大鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡、緩解其PD癥狀,從而在PD的病理進(jìn)程中起到保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R742.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1328410