本文關(guān)鍵詞：ANLN基因在膀胱尿路上皮癌中的作用及機(jī)制研究　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：【背景】膀胱癌是我國發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)腫瘤,臨床上,近半數(shù)膀胱癌患者在確診時已處于中晚期,即腫瘤已發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移,臨床治療效果很差。膀胱癌根據(jù)不同病理分期,可分為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)以及肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),NMIBC以經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)為主,而MIBC則為全膀胱根治性切除加淋巴結(jié)清掃術(shù)。然而,膀胱癌患者術(shù)后預(yù)后差異極大,大約60%的NMIBC患者行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后會復(fù)發(fā),而MIBC患者行全膀胱根治性切除術(shù)后仍有約50%患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此,對于膀胱癌發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)基因的分子機(jī)制及其臨床腫瘤學(xué)意義的深入研究,有助于探索膀胱癌分子分型,實(shí)現(xiàn)膀胱癌個體化治療。最新高通量測序手段、生物信息學(xué)分析等手段為深入研究膀胱腫瘤的發(fā)病機(jī)制提供良好的平臺,可以有效分析腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路和關(guān)鍵靶點(diǎn),為腫瘤早期診斷、個體化治療提供可行的依據(jù)。目前對于國人的膀胱癌全基因組測序相關(guān)研究尚缺乏,為此我科室膀胱癌課題研究組自2011年即開始聯(lián)合深圳華大基因研究院,運(yùn)用第二代基因測序手段對膀胱癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入研究,探索膀胱癌發(fā)生及發(fā)展機(jī)制及尋找分子分型標(biāo)記物�！灸康摹客ㄟ^第二代基因測序探索膀胱癌與配對正常尿路上皮差異表達(dá)分子,尋找與膀胱癌發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)的基因,探索其在膀胱癌分子分型中的作用及其在膀胱癌中的生物學(xué)功能�！静牧吓c方法】1.提取10例行膀胱癌根治術(shù)患者膀胱癌組織及其配對的癌旁正常尿路上皮行轉(zhuǎn)錄組二代基因測序。通過生物信息學(xué)分析結(jié)合文獻(xiàn)報道,篩選出候選基因行進(jìn)一步驗(yàn)證及功能探討。2.抽提40對膀胱癌組織及配對正常尿路上皮組織RNA行q RT-PCR,檢驗(yàn)ANLN基因m RNA表達(dá)量,達(dá)并探索ANLN基因與膀胱癌分級、分期的關(guān)系。3.通過公共測序信息數(shù)據(jù)庫GEO(Gene Expression Omnibus)及TCGA(The Cancer Genome Atlas,TCGA)行數(shù)據(jù)挖掘,驗(yàn)證其中ANLN基因表達(dá)量與膀胱癌病理分期及預(yù)后關(guān)系。4.對209例膀胱癌患者的腫瘤組織石蠟切片行免疫組化染色方法,探討ANLN編碼蛋白Anillin的表達(dá)量,比較Anillin在膀胱腫瘤組織及正常尿路上皮中表達(dá)量差異。探討Anillin表達(dá)量與膀胱癌病理分級、分期關(guān)系及其與患者預(yù)后關(guān)系。5.通過q RT-PCR檢測7種膀胱癌細(xì)胞系A(chǔ)NLN基因m RNA表達(dá)量。采用瞬轉(zhuǎn)干擾RNA(si RNA)方法對ANLN基因高表達(dá)細(xì)胞系J82及5637行基因敲減,通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測ANLN基因敲減對J82及5637細(xì)胞增殖能力影響。通過構(gòu)建慢病毒實(shí)現(xiàn)對J82細(xì)胞系A(chǔ)NLN基因的穩(wěn)定敲減。利用慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)J82細(xì)胞建立膀胱癌裸鼠皮下成瘤及原位膀胱腫瘤模型,通過在體動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ANLN基因與膀胱癌細(xì)胞增殖能力關(guān)系。6.通過細(xì)胞劃痕及Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)探索ANLN基因敲減對膀胱癌細(xì)胞J82及5637遷移、侵襲能力的影響。7.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測探索ANLN基因敲減對膀胱癌細(xì)胞J82及5637細(xì)胞周期及凋亡影響。8.通過免疫熒光染色及細(xì)胞蘇木素伊紅染色探索ANLN基因敲減對J82細(xì)胞有絲分裂及細(xì)胞形態(tài)影響。9.通過基因芯片分析J82細(xì)胞ANLN敲減組與對照組差異表達(dá)基因,探索ANLN基因參與膀胱癌發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制及其與其他信號通路、基因的相互作用�！窘Y(jié)果】1.10例膀胱癌組織及其配對癌旁正常尿路上皮轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)信號分子,本研究采用以下條件對差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選:(1)差異表達(dá)倍數(shù)log2-fold change"g2;(2)每對樣本測序RPKM值"g10;(3)候選基因在10對測序樣本中至少8對表達(dá)趨勢一致;(4)候選基因在膀胱癌組織與配對正常尿路上皮差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即probability"g0.8(相當(dāng)于p值0.01);(5)候選基因在已有膀胱癌研究文獻(xiàn)中無報道。通過上述條件篩選,ANLN基因符合以上所有要求,其log2-fold change倍數(shù)為2.926;ANLN差異表達(dá)probability為0.835;ANLN在每對樣本中測序RPKM值均"g10;測序10對樣本中,ANLN在9對膀胱癌組織中表達(dá)量顯著高于配對正常尿路上皮;尚無研究報道ANLN基因在膀胱癌中有相關(guān)作用。2.選取40例患者膀胱癌組織及其配對正常尿路上皮組織行q RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測ANLN基因表達(dá)量,40例患者中36例膀胱癌組織ANLN表達(dá)量顯著高于配對正常尿路上皮。將40例驗(yàn)證標(biāo)本按照不同病理分期及分級分類,分別分析ANLN基因表達(dá)量。ANLN基因在肌層浸潤性膀胱癌表達(dá)量明顯高于非肌層浸潤性膀胱癌,而ANLN基因表達(dá)量在高級別與低級別膀胱癌之間無明顯差異。3.209例膀胱癌組織石蠟切片ANLN免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)肌層浸潤性膀胱癌ANLN表達(dá)量顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌(p0.01),高級別膀胱癌中ANLN表達(dá)量顯著高于低級別膀胱癌(p0.01)�；颊咂骄S訪27.9月,高表達(dá)ANLN膀胱癌患者腫瘤特異生存時間(中位生存時間為22.4月)明顯低于ANLN低表達(dá)患者(中位生存時間為37.3月,p=0.001);ANLN高表達(dá)患者腫瘤無進(jìn)展生存時間(中位時間為19.7月)顯著低于ANLN低表達(dá)患者(中位時間為27.9月,p=0.001);ANLN高表達(dá)患者腫瘤無復(fù)發(fā)生存時間(中位時間為17.1月)顯著低于ANLN低表達(dá)膀胱癌患者(中位時間為25.2月,p=0.011)。4.公共測序數(shù)據(jù)庫NCBI-GEO數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步證實(shí)ANLN基因在肌層浸潤性膀胱癌中表達(dá)量顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌(p0.01)。TCGA數(shù)據(jù)庫分析則證實(shí)ANLN基因高表達(dá)患者腫瘤特異生存時間(中位生存時間14.75月)明顯低于ANLN基因低表達(dá)患者(中位生存時間36.86月,p=0.007)。5.CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,與陰性對照組相比,si RNA干擾ANLN基因表達(dá)導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞J82與5637增殖能力顯著減弱。裸鼠皮下成瘤膀胱癌模型及原位膀胱腫瘤模型進(jìn)一步證實(shí)ANLN基因敲減導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞增殖能力減弱。6.劃痕實(shí)驗(yàn)中,敲減ANLN基因后J82細(xì)胞與5637細(xì)胞的遷移能力較陰性對照組顯著下降。在Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中,敲減ANLN基因可以顯著抑制J82和5637細(xì)胞的侵襲能力。7.與陰性對照組相比,敲減ANLN基因?qū)е翵82及5637細(xì)胞出現(xiàn)G2期阻滯,而敲減ANLN基因?qū)τ贘82與5637細(xì)胞凋亡則無明顯影響。Western-blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)ANLN基因敲減可導(dǎo)致J82與5637細(xì)胞中Cyclin B1與Cyclin D1蛋白表達(dá)降低。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示ANLN蛋白參與有絲分裂過程中分裂溝形成。而細(xì)胞蘇木素伊紅染色則提示ANLN基因敲減導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞有絲分裂障礙,多核膀胱癌細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著增加。8.通過對ANLN基因敲減組與陰性對照組基因表達(dá)芯片分析,ANLN敲減引起的差異表達(dá)基因GO分析結(jié)果顯示其功能主要與細(xì)胞移動、遷移能力有關(guān)。而差異表達(dá)基因KEGG信號通路分析則提示ANLN基因參與膀胱癌發(fā)生及進(jìn)展的過程與Jak-STAT信號通路,Toll-like信號通路,PI3K/AKT信號通路,TNF信號通路有關(guān)�！窘Y(jié)論】ANLN基因及其編碼的蛋白在膀胱癌組織中高表達(dá),且其表達(dá)水平與膀胱癌的病理分級與分期相關(guān),ANLN高表達(dá)是膀胱癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險因子。ANLN基因與膀胱癌進(jìn)展密切相關(guān),干擾ANLN基因表達(dá)可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。ANLN基因通過調(diào)控膀胱癌細(xì)胞有絲分裂及細(xì)胞周期參與調(diào)控膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)功能,并與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)的PI3K/AKT,TNF等信號通路相互作用。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.14

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