發(fā)布時間：2017-12-24 08:24

  本文關(guān)鍵詞：ANLN基因在膀胱尿路上皮癌中的作用及機制研究　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關(guān)文章： 膀胱尿路上皮癌 轉(zhuǎn)錄組測序 ANLN 生物標記物 預后 生物學功能

【摘要】：【背景】膀胱癌是我國發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)腫瘤,臨床上,近半數(shù)膀胱癌患者在確診時已處于中晚期,即腫瘤已發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移,臨床治療效果很差。膀胱癌根據(jù)不同病理分期,可分為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)以及肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),NMIBC以經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)為主,而MIBC則為全膀胱根治性切除加淋巴結(jié)清掃術(shù)。然而,膀胱癌患者術(shù)后預后差異極大,大約60%的NMIBC患者行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后會復發(fā),而MIBC患者行全膀胱根治性切除術(shù)后仍有約50%患者發(fā)生局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移。因此,對于膀胱癌發(fā)生及進展密切相關(guān)基因的分子機制及其臨床腫瘤學意義的深入研究,有助于探索膀胱癌分子分型,實現(xiàn)膀胱癌個體化治療。最新高通量測序手段、生物信息學分析等手段為深入研究膀胱腫瘤的發(fā)病機制提供良好的平臺,可以有效分析腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路和關(guān)鍵靶點,為腫瘤早期診斷、個體化治療提供可行的依據(jù)。目前對于國人的膀胱癌全基因組測序相關(guān)研究尚缺乏,為此我科室膀胱癌課題研究組自2011年即開始聯(lián)合深圳華大基因研究院,運用第二代基因測序手段對膀胱癌發(fā)病機制進行了深入研究,探索膀胱癌發(fā)生及發(fā)展機制及尋找分子分型標記物�！灸康摹客ㄟ^第二代基因測序探索膀胱癌與配對正常尿路上皮差異表達分子,尋找與膀胱癌發(fā)生及進展密切相關(guān)的基因,探索其在膀胱癌分子分型中的作用及其在膀胱癌中的生物學功能�！静牧吓c方法】1.提取10例行膀胱癌根治術(shù)患者膀胱癌組織及其配對的癌旁正常尿路上皮行轉(zhuǎn)錄組二代基因測序。通過生物信息學分析結(jié)合文獻報道,篩選出候選基因行進一步驗證及功能探討。2.抽提40對膀胱癌組織及配對正常尿路上皮組織RNA行q RT-PCR,檢驗ANLN基因m RNA表達量,達并探索ANLN基因與膀胱癌分級、分期的關(guān)系。3.通過公共測序信息數(shù)據(jù)庫GEO(Gene Expression Omnibus)及TCGA(The Cancer Genome Atlas,TCGA)行數(shù)據(jù)挖掘,驗證其中ANLN基因表達量與膀胱癌病理分期及預后關(guān)系。4.對209例膀胱癌患者的腫瘤組織石蠟切片行免疫組化染色方法,探討ANLN編碼蛋白Anillin的表達量,比較Anillin在膀胱腫瘤組織及正常尿路上皮中表達量差異。探討Anillin表達量與膀胱癌病理分級、分期關(guān)系及其與患者預后關(guān)系。5.通過q RT-PCR檢測7種膀胱癌細胞系A(chǔ)NLN基因m RNA表達量。采用瞬轉(zhuǎn)干擾RNA(si RNA)方法對ANLN基因高表達細胞系J82及5637行基因敲減,通過CCK-8實驗檢測ANLN基因敲減對J82及5637細胞增殖能力影響。通過構(gòu)建慢病毒實現(xiàn)對J82細胞系A(chǔ)NLN基因的穩(wěn)定敲減。利用慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)J82細胞建立膀胱癌裸鼠皮下成瘤及原位膀胱腫瘤模型,通過在體動物實驗驗證ANLN基因與膀胱癌細胞增殖能力關(guān)系。6.通過細胞劃痕及Transwell小室細胞侵襲實驗探索ANLN基因敲減對膀胱癌細胞J82及5637遷移、侵襲能力的影響。7.通過流式細胞術(shù)檢測探索ANLN基因敲減對膀胱癌細胞J82及5637細胞周期及凋亡影響。8.通過免疫熒光染色及細胞蘇木素伊紅染色探索ANLN基因敲減對J82細胞有絲分裂及細胞形態(tài)影響。9.通過基因芯片分析J82細胞ANLN敲減組與對照組差異表達基因,探索ANLN基因參與膀胱癌發(fā)生及發(fā)展的機制及其與其他信號通路、基因的相互作用�！窘Y(jié)果】1.10例膀胱癌組織及其配對癌旁正常尿路上皮轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)大量差異表達信號分子,本研究采用以下條件對差異表達基因進行篩選:(1)差異表達倍數(shù)log2-fold change"g2;(2)每對樣本測序RPKM值"g10;(3)候選基因在10對測序樣本中至少8對表達趨勢一致;(4)候選基因在膀胱癌組織與配對正常尿路上皮差異表達具有統(tǒng)計學意義,即probability"g0.8(相當于p值0.01);(5)候選基因在已有膀胱癌研究文獻中無報道。通過上述條件篩選,ANLN基因符合以上所有要求,其log2-fold change倍數(shù)為2.926;ANLN差異表達probability為0.835;ANLN在每對樣本中測序RPKM值均"g10;測序10對樣本中,ANLN在9對膀胱癌組織中表達量顯著高于配對正常尿路上皮;尚無研究報道ANLN基因在膀胱癌中有相關(guān)作用。2.選取40例患者膀胱癌組織及其配對正常尿路上皮組織行q RT-PCR實驗檢測ANLN基因表達量,40例患者中36例膀胱癌組織ANLN表達量顯著高于配對正常尿路上皮。將40例驗證標本按照不同病理分期及分級分類,分別分析ANLN基因表達量。ANLN基因在肌層浸潤性膀胱癌表達量明顯高于非肌層浸潤性膀胱癌,而ANLN基因表達量在高級別與低級別膀胱癌之間無明顯差異。3.209例膀胱癌組織石蠟切片ANLN免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)肌層浸潤性膀胱癌ANLN表達量顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌(p0.01),高級別膀胱癌中ANLN表達量顯著高于低級別膀胱癌(p0.01)�；颊咂骄S訪27.9月,高表達ANLN膀胱癌患者腫瘤特異生存時間(中位生存時間為22.4月)明顯低于ANLN低表達患者(中位生存時間為37.3月,p=0.001);ANLN高表達患者腫瘤無進展生存時間(中位時間為19.7月)顯著低于ANLN低表達患者(中位時間為27.9月,p=0.001);ANLN高表達患者腫瘤無復發(fā)生存時間(中位時間為17.1月)顯著低于ANLN低表達膀胱癌患者(中位時間為25.2月,p=0.011)。4.公共測序數(shù)據(jù)庫NCBI-GEO數(shù)據(jù)分析進一步證實ANLN基因在肌層浸潤性膀胱癌中表達量顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌(p0.01)。TCGA數(shù)據(jù)庫分析則證實ANLN基因高表達患者腫瘤特異生存時間(中位生存時間14.75月)明顯低于ANLN基因低表達患者(中位生存時間36.86月,p=0.007)。5.CCK-8細胞增殖實驗顯示,與陰性對照組相比,si RNA干擾ANLN基因表達導致膀胱癌細胞J82與5637增殖能力顯著減弱。裸鼠皮下成瘤膀胱癌模型及原位膀胱腫瘤模型進一步證實ANLN基因敲減導致膀胱癌細胞增殖能力減弱。6.劃痕實驗中,敲減ANLN基因后J82細胞與5637細胞的遷移能力較陰性對照組顯著下降。在Transwell細胞侵襲實驗中,敲減ANLN基因可以顯著抑制J82和5637細胞的侵襲能力。7.與陰性對照組相比,敲減ANLN基因?qū)е翵82及5637細胞出現(xiàn)G2期阻滯,而敲減ANLN基因?qū)τ贘82與5637細胞凋亡則無明顯影響。Western-blot實驗證實ANLN基因敲減可導致J82與5637細胞中Cyclin B1與Cyclin D1蛋白表達降低。免疫熒光實驗顯示ANLN蛋白參與有絲分裂過程中分裂溝形成。而細胞蘇木素伊紅染色則提示ANLN基因敲減導致膀胱癌細胞有絲分裂障礙,多核膀胱癌細胞數(shù)量較對照組顯著增加。8.通過對ANLN基因敲減組與陰性對照組基因表達芯片分析,ANLN敲減引起的差異表達基因GO分析結(jié)果顯示其功能主要與細胞移動、遷移能力有關(guān)。而差異表達基因KEGG信號通路分析則提示ANLN基因參與膀胱癌發(fā)生及進展的過程與Jak-STAT信號通路,Toll-like信號通路,PI3K/AKT信號通路,TNF信號通路有關(guān)�！窘Y(jié)論】ANLN基因及其編碼的蛋白在膀胱癌組織中高表達,且其表達水平與膀胱癌的病理分級與分期相關(guān),ANLN高表達是膀胱癌患者不良預后的獨立危險因子。ANLN基因與膀胱癌進展密切相關(guān),干擾ANLN基因表達可顯著抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力。ANLN基因通過調(diào)控膀胱癌細胞有絲分裂及細胞周期參與調(diào)控膀胱癌細胞生物學功能,并與腫瘤發(fā)生及進展密切相關(guān)的PI3K/AKT,TNF等信號通路相互作用。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.14

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 嘉勉;膀胱癌基因被確認[J];遼寧醫(yī)學雜志;2004年03期

2 青云;英國科學家辨別出與膀胱癌有關(guān)的基因[J];中國處方藥;2004年08期

3 ;特殊激素可導致男性患膀胱癌幾率升高[J];中國社區(qū)醫(yī)師(綜合版);2007年11期

4 肖建利;張麗芳;劉巧莉;;白花蛇舌草治療膀胱癌1例[J];臨床合理用藥雜志;2009年08期

5 丁虹彬，余雪軒;培養(yǎng)膀胱癌細胞的新方法[J];南京醫(yī)學院學報;1994年01期

6 張曉峰;劉訓勤;;一種新型膀胱癌快速診斷裝置[J];醫(yī)療衛(wèi)生裝備;2013年10期

7 孫宏志,凡杰,唐孝達;自穩(wěn)定反義IGF1R基因片段對膀胱癌細胞的影響[J];中華泌尿外科雜志;2000年05期

8 章小平,楊紅枚,魯功成;膀胱癌穩(wěn)定表達多藥耐受相關(guān)蛋白亞克隆的生物學特征[J];中華實驗外科雜志;2000年03期

9 漆少廷,徐錫坤,王心如;膀胱癌的分子生物學研究進展[J];國外醫(yī)學.泌尿系統(tǒng)分冊;2000年04期

10 章小平,楊紅枚,魯功成;流式細胞儀在膀胱癌多藥耐受研究中的應用[J];臨床泌尿外科雜志;2000年09期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張永春;谷江;孫發(fā);石家齊;;傳統(tǒng)醫(yī)學在膀胱癌治療中的意義[A];2010年貴州省泌尿外科學術(shù)會議論文集[C];2010年

2 潘春武;沈周俊;唐小瑩;王e，

本文編號：1327578