本文關(guān)鍵詞：周期蛋白依賴性激酶-6基因在鼻咽癌中的表達及分子功能的初步研究　出處：《南方醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景與內(nèi)容鼻咽癌是中國南方和東南亞地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一。它的發(fā)生是一個多基因、多階段、多途徑的進程,對鼻咽癌相關(guān)新基因的研究仍將有助于我們更好的揭示鼻咽癌的發(fā)病機理。本研究在所在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,采用基因芯片技術(shù),結(jié)合前期實驗的結(jié)果,篩選出了細胞周期依賴性激酶CDK6作為本次研究的對象,并觀察到了其細胞周期信號通路的異常表現(xiàn)�；谝陨涎芯拷Y(jié)果,本研究為了明確CDK6在鼻咽癌中的作用,了解其參與了哪些miRNA的表達和調(diào)控途徑,開展以下研究。研究內(nèi)容與方法1.采用免疫組化和熒光定量等方法檢測CDK6在鼻咽癌組織和細胞系中的表達水平,并結(jié)合臨床資料進行統(tǒng)計學分析。2.利用瞬時轉(zhuǎn)染法沉默CDK6基因在鼻咽癌細胞中的表達,通過MTT、tranwell、boyden等手段研究其對于鼻咽癌細胞生物學特性的影響。3.對干擾CDK6表達的鼻咽癌細胞進行miRNA芯片表達譜的分析,并通過MTT、tranwell、boyden、藥敏試驗等手段對篩選出的目標miRNA進行功能和機制學的研究。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果顯示,CDK6在鼻咽癌組織和細胞系中,均以高表達為主,與正常鼻咽上皮組織以及細胞系相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。PCR驗證后的結(jié)果相同。同時,有CDK6的核表達的患者的總生存率較無CDK6的核表達的患者更差。2.沉默CDK6基因?qū)Ρ茄拾┘毎飳W行為的影響采用瞬時轉(zhuǎn)染法,感染HONE1和5-8F細胞,western blot驗證其感染效率明確,用于后續(xù)實驗。1)采用MTT法檢測CDK6基因沉默后細胞的體外增殖情況,結(jié)果顯示,與空白對照組相比,實驗組細胞的增殖速度顯著減慢,結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。2)Transwell小室檢測CDK6沉默后鼻咽癌細胞體外遷徙運動能力的變化,結(jié)果顯示,與空白對照組相比,干擾CDK6后的細胞運動能力明顯減弱。3)Boyden小室檢測CDK6基因沉默后鼻咽癌細胞體外侵襲運動能力的改變,結(jié)果顯示干擾CDK6后,鼻咽癌細胞的侵襲能力顯著降低。3.沉默CDK6表達后,利用miRNA芯片進行表達譜分析及機制、功能驗證。沉默CDK6表達后,利用miRNA表達譜芯片篩選出表達差異最顯著的Let-7d做為下一步研究對象。1)采用Let-7dmimics/inhibitor轉(zhuǎn)染后,MTT法檢測增殖情況,與空載對照組相比,Let-7d mimics組細胞生長速度明顯降低(P0.001),Let-7d inhibitor組細胞生長速度明顯增快(P0.001),結(jié)果有統(tǒng)計學意義。2)Transwell小室遷移實驗,相比于對照,Let-7d mimics組細胞穿膜的數(shù)量減少,Let-7d inhibitor組細胞穿膜的數(shù)量增加,差異有統(tǒng)計學意義(Mimics t=7.572,P0.001,Inhibitor t=5.494,P0.001)。3)Boyden小室侵襲實驗,相比于對照組,Let-7d mimics組細胞穿膜數(shù)量減少,Let-7dinhibitor組細胞穿膜數(shù)量增加,差異有統(tǒng)計學意義。4)western blot檢測,Let-7d mimics 轉(zhuǎn)染細胞后細胞周期基因c-myc表達下調(diào)。反之,Let-7d inhibitor組中,則c-myc表達上調(diào)。5)采用MTT法對CDK6以及l(fā)et-7d表達改變導(dǎo)致鼻咽癌細胞對(5-fu)藥物敏感性的影響進行了檢測。觀察到let-7d能夠增高NPC細胞對5-Fu的藥物敏感性。結(jié)論:1.CDK6在鼻咽癌組織中較正常鼻咽組織表達明顯上調(diào),其核表達陽性與患者生存率明顯相關(guān);2.CDK6基因能夠增強鼻咽癌細胞的體外增殖能力,并促進其遷移和侵襲,對鼻咽癌的發(fā)生其正向調(diào)節(jié)作用。3.CDK6可能與miRNA中的let-7d存在負相關(guān)性,并通過鼻咽癌相關(guān)蛋白c-myc調(diào)節(jié)let-7d的表達,兩者之間可能存在負性反饋環(huán)路。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.63

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