本文關(guān)鍵詞：極光激酶A對宮頸鱗狀細(xì)胞癌的影響及其機制研究

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【摘要】：目的:根治性放射治療(有或無DPP為基礎(chǔ)的化療)是宮頸鱗狀細(xì)胞癌最有效的治療方法之一,但是因為治療抵抗導(dǎo)致治療效果仍然非常有限。在這項研究中,我們探討極光激酶A表達(dá)與放射治療反應(yīng)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)性。探討用極光激酶A選擇性小分子抑制劑MLN8237聯(lián)合DPP、多西他賽對宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(HCC94、SiHa)的體外影響,并檢測MLN8237對宮頸永生化細(xì)胞系H8的影響以檢測MLN8237對正常細(xì)胞的毒性反應(yīng),同時探討用極光激酶A抑制劑對宮頸鱗狀細(xì)胞癌放射治療的影響及對化放療增敏的機制。方法:1)采用免疫組化方法檢測極光激酶A在未接受任何治療的129例初始接受根治性放射治療的維吾爾族宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者組織中的表達(dá)水平,放射治療給予外照射+內(nèi)照射(A點劑量70-85Gy)伴或不伴順鉑為基礎(chǔ)的化療,分析極光激酶A不同表達(dá)水平對預(yù)后意義。2)以MLN8237,DPP,多西他賽,各單藥組作用于HCC94、Si Ha細(xì)胞,并設(shè)調(diào)零組及不加藥對照組,采用MTT比色法測各組HCC94、SiHa細(xì)胞的增殖抑制率;3)以MLN8237高劑量處理H8細(xì)胞,MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖抑制率。4)以各藥物小劑量濃度聯(lián)合作用24h,采用MTT比色法測各組HCC94、Si Ha細(xì)胞的增殖抑制率。5)以三者1/2 IC50(48h)組合,IC50(48h)組合,采用MTT比色法測各組HCC94、SiHa細(xì)胞的增殖抑制率。6)以克隆形成實驗驗證以上MTT結(jié)果。7)以2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy放射劑量單獨或聯(lián)合MLN8237觀察HCC94、Si Ha細(xì)胞平板克隆形成率,利用單擊多靶模型擬合生存曲線,并計算外推值N,平均致死劑量D0和準(zhǔn)閾劑量Dq以及放射增敏比SER。8)流式檢測MLN8237處理HCC94、SiHa細(xì)胞后細(xì)胞周期、凋亡。MLN8237處理HCC94、SiHa細(xì)胞,設(shè)立對照,劃痕檢測遷移能力。MLN8237處理HCC94、Si Ha細(xì)胞,Q-PCR檢測極光激酶A mRNA的變化,蛋白印跡檢測極光激酶A蛋白、磷酸化(T288)極光激酶A蛋白的變化。結(jié)果:1)極光激酶A表達(dá)水平與宮頸癌不良預(yù)后相關(guān)的因素相關(guān),包括淋巴轉(zhuǎn)移(P0.001),腫瘤體積大(P0.001),低血紅蛋白水平(P=0.011)和復(fù)發(fā)(P0.001)。極光激酶A高表達(dá)和低表達(dá)臨床放射治療反應(yīng)有差異,極光激酶A高表達(dá)患者放射治療反應(yīng)相對抗拒(P0.001)。單因素分析顯示淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大、低血紅蛋白水平、極光激酶A過表達(dá)影響無復(fù)發(fā)生存和總生存。然而,多因素分析顯示只有極光激酶A高表達(dá)可作為無復(fù)發(fā)生存(hazard ratio,3.953;95%CI,1.473-10.638;P=0.006)和總生存(hazard ratio 9.091;95%CI 2.597-32.258;P0.001)的獨立預(yù)后因素。2)MLN8237單藥處理細(xì)胞時,各組對HCC94、Si Ha細(xì)胞生存率均比對照組降低(P0.05),隨著給藥時間延長,細(xì)胞存活率逐漸降低(P0.05)。DPP、多西他賽也呈同樣趨勢。與對照相比,MLN8237的濃度高達(dá)80uM時沒有引起H8細(xì)胞活性降低(P0.05),甚至高達(dá)320u M時僅導(dǎo)致小量毒性(細(xì)胞存活率85%)。3)MLN8237與DDP或者多西他賽聯(lián)合處理各細(xì)胞24h時,各濃度聯(lián)合作用組均較相同濃度單藥存活率降低(P0.05)。MLN8237與DDP或者多西他賽聯(lián)合組各藥物之間有交互作用,各藥物最高濃度聯(lián)合組效果最好。三藥1/2 IC50(48h)濃度聯(lián)用HCC94、SiHa細(xì)胞存活率分別僅為15.859±4.657%,18.678±5.387%;三藥IC50(48h)聯(lián)用HCC94、Si Ha細(xì)胞存活率更低分別僅為6.957±5.846%,9.561±6.241%。進一步在平板克隆形成實驗中也得到證實。4)單擊多靶模型繪制出細(xì)胞輻射存活曲線,可見無論是HCC94細(xì)胞,還是SiHa細(xì)胞,聯(lián)合組曲線較單純照射組左移,且較為平直,“肩區(qū)”不明顯。5)劃痕實驗檢測MLN8237處理24h細(xì)胞,與對照組比較,明顯抑制細(xì)胞遷移。流式細(xì)胞周期檢測MLN8237處理HCC94、SiHa細(xì)胞,與對照組比較,G2/M期明顯增加,多倍體細(xì)胞比例明顯增高,G0/G1+S期比例明顯降低(P0.05);流式細(xì)胞凋亡檢測MLN8237處理HCC94、SiHa細(xì)胞,與對照組比較,凋亡細(xì)胞明顯增多(P0.05),并隨時間和劑量增加,變化越明顯。6)MLN8237處理前后極光激酶A mRNA未見顯著性差異,極光激酶A蛋白也未見明顯變化,(T288)磷酸化極光激酶A蛋白表達(dá)顯著被抑制,甚至表達(dá)消失。結(jié)論:1)極光激酶A高表達(dá)可預(yù)測放射治療反應(yīng)相對抗拒和預(yù)后相對差。2)在臨床應(yīng)用中,對不能耐受大劑量順鉑或多西他賽的患者,我們可以加適當(dāng)劑量MLN8237,適當(dāng)減少順鉑或多西他賽劑量,以期在不增加毒副反應(yīng)的情況下,達(dá)到相同甚至更好的治療效果。而對于毒副反應(yīng)耐受的患者,我們應(yīng)在機體耐受范圍內(nèi),盡可能提高MLN8237和順鉑或者多西他賽的劑量,以充分發(fā)揮抗腫瘤效果。3)在臨床應(yīng)用中,小劑量選擇性極光激酶A抑制劑MLN8237對宮頸鱗狀細(xì)胞癌均有放療增敏作用,相同劑量選擇性極光激酶A抑制劑MLN8237對放射抵抗宮頸癌的放射增敏比與相對敏感的腫瘤相比相對更大;同時適當(dāng)增大MLN8237劑量可增強放射增敏效果。4)MLN8237體外對化放療的增敏機制可能通過顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移能力,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G2/M周期阻滯、多倍體形成,誘導(dǎo)凋亡實現(xiàn)的。5)MLN8237在體外并不抑制轉(zhuǎn)錄水平,也不影響翻譯水平,而是改變了極光激酶A空間構(gòu)象從而影響了其活性。
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

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本文編號：1307299