本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌感染相關(guān)非編碼RNAs篩選鑒定與功能研究

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【摘要】：目的:幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)為人胃部疾病的重要致病菌之一,世界范圍內(nèi)感染率達到60%。幽門螺桿菌的致病機理非常復雜,目前主要認為是幽門螺桿菌毒力因子及宿主免疫應答所介導的胃黏膜持續(xù)性損傷,其中的具體分子調(diào)控機制尚不清楚。近年來研究表明,非編碼RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs),主要是微小RNAs(microRNAs,mi RNAs)和長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs),它們作為調(diào)控性分子在眾多生物學過程及疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。但目前參與幽門螺桿菌感染致病的非編碼RNAs尚未完全發(fā)現(xiàn)且功能不明,本研究以生物信息學、分子生物學、細胞生物學、免疫學等技術(shù)篩選、鑒定幽門螺桿菌感染相關(guān)非編碼RNAs,并以其中的hsa-mir-29a-3p為研究對象,探討其功能,為研究非編碼RNAs在幽門螺桿菌感染的致病機制中的調(diào)控作用奠定基礎。方法:1、幽門螺桿菌26695菌株與胃黏膜GES-1細胞以MOI=100:1共培養(yǎng),以炎癥指標IL-8、COX-2的升高驗證感染模型的成立。2、基因芯片檢測幽門螺桿菌感染組和非感染對照組胃黏膜GES-1細胞編碼和非編碼基因的表達譜,并用系統(tǒng)聚類分析差異表達的編碼和非編碼基因。3、根據(jù)差異表達基因的芯片信號強度基于皮爾遜相關(guān)系數(shù)法構(gòu)建非編碼基因和編碼基因的共表達網(wǎng)絡;運用Gene Ontology和KEGG Pathway富集分析差異共表達的編碼基因。4、用實時熒光定量PCR技術(shù)鑒定芯片結(jié)果,初步篩選差異表達的非編碼RNAs;并在不同菌株、不同胃黏膜細胞的感染模型中鑒定非編碼RNAs的表達。5、收集臨床胃黏膜標本;在臨床胃黏膜標本中鑒定非編碼RNAs表達;并運用ANOVA-post hoc分析差異表達非編碼RNAs與幽門螺桿菌感染相關(guān)胃黏膜病理改變之間的相關(guān)性。6、以差異表達hsa-mir-29a-3p為研究對象,qrt-pcr檢測不同感染模型及臨床標本中hsa-mir-29a-3p的表達情況。7、轉(zhuǎn)染hsa-mir-29a-3p的模擬物/抑制劑,提取細胞總蛋白,westernblot檢測信號轉(zhuǎn)導、炎癥、腫瘤形成等相關(guān)指標的表達。8、利用生物信息學平臺預測hsa-mir-29a-3p潛在靶基因;構(gòu)建靶基因3’utr靶位點和突變體雙熒光素酶報告載體,與hsa-mir-29a-3p模擬物/抑制劑共轉(zhuǎn)染hek-293細胞,檢測熒光強度的變化,確定靶基因。9、用westernblot驗證hsa-mir-29a-3p對靶基因蛋白表達的調(diào)控以及在幽門螺桿菌感染中hsa-mir-29a-3p對靶基因蛋白表達的調(diào)控,確認hsa-mir-29a-3p-靶基因的表達網(wǎng)絡受幽門螺桿菌感染的調(diào)控。10、用westernblot驗證hsa-mir-29a-3p靶基因在不同感染模型中的表達;qrt-pcr及免疫組化實驗檢測臨床標本中hsa-mir-29a-3p靶基因的表達情況,分析hsa-mir-29a靶基因表達是否與hsa-mir-29a-3p的表達呈負相關(guān)。11、過表達或敲減胃黏膜細胞中hsa-mir-29a-3p靶基因的表達,westernblot、免疫熒光、elisa等技術(shù)檢測靶基因?qū)f-κb通路的調(diào)控作用以及在幽門螺桿菌感染中hsa-mir-29a-3p靶基因?qū)f-κb通路的調(diào)控影響。結(jié)果:1、在成功構(gòu)建體外感染模型基礎上,芯片分析幽門螺桿菌感染的胃黏膜ges-1細胞中基因表達譜的變化,共篩選出565個差異基因和347個差異非編碼rnas(foldchange≥2或≤0.5,p0.05)。2、構(gòu)建了差異編碼基因-非編碼基因的共表達網(wǎng)絡,go和keggpathway富集分析表明差異基因在細胞增殖與分化、轉(zhuǎn)移、凋亡、免疫應答及基因轉(zhuǎn)錄等生物學行注釋中以及相關(guān)信號通路中富集。3、從細胞模型和臨床標本中篩選獲得了幽門螺桿菌感染相關(guān)的四條差異表達長鏈非編碼rnas(n345630、xloc_004787、n378726和linc00473)和三條差異表達微小rnas(hsa-mir-4500、hsa-mir-29a、hsa-mir-221)。4、xloc_004787、linc00473與幽門螺桿菌感染的慢性炎癥、腸化生密切相關(guān),hsa-mir-29a、hsa-mir-221與幽門螺桿菌感染的慢性炎癥密切相關(guān),hsa-mir-221與幽門螺桿菌感染的胃癌有相關(guān)性。5、預測并鑒定了hsa-mir-29a-3p在胃黏膜細胞中的靶基因為A20,hsa-mir-29a-3p能直接介導靶基因A20蛋白的表達抑制;幽門螺桿菌的感染誘導hsa-mir-29a-3p上調(diào)進而調(diào)控A20蛋白的表達。6、靶基因A20在胃黏膜細胞中參與了NF-κB通路的調(diào)控;hsa-mir-29a-3p通過調(diào)控靶基因A20的表達,在胃黏膜細胞中間接參與了幽門螺桿菌感染誘導的相關(guān)炎癥反應。結(jié)論:1、利用高通量基因芯片技術(shù)分析篩選獲得了幽門螺桿菌感染相關(guān)的非編碼RNAs和編碼基因的差異表達譜。我們認為分析幽門螺桿菌感染相關(guān)的非編碼RNAs的表達有助于從非編碼調(diào)控分子的角度更好了解幽門螺桿菌感染致病的機制。2、建立了幽門螺桿菌感染相關(guān)的差異編碼基因-非編碼基因的共表達網(wǎng)絡,進一步對非編碼RNAs共表達的差異編碼基因進行GO和KEGG Pathway富集分析,為推斷幽門螺桿菌感染相關(guān)非編碼RNAs的生物學功能及潛在參與調(diào)控的信號通路奠定相關(guān)理論基礎。3、篩選獲得了差異表達的非編碼RNAs,與幽門螺桿菌感染相關(guān)胃黏膜疾病密切相關(guān)。4、Hsa-mir-29a-3p高表達與幽門螺桿菌的感染相關(guān);hsa-mir-29a-3p在胃黏膜細胞中的靶基因是A20;hsa-mir-29a-3p通過調(diào)控靶基因A20的表達,在胃黏膜細胞中可能參與了幽門螺桿菌感染誘導的相關(guān)炎癥反應的負向調(diào)控。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R573

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本文編號：1306238