本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌感染相關(guān)非編碼RNAs篩選鑒定與功能研究

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【摘要】：目的:幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)為人胃部疾病的重要致病菌之一,世界范圍內(nèi)感染率達(dá)到60%。幽門螺桿菌的致病機(jī)理非常復(fù)雜,目前主要認(rèn)為是幽門螺桿菌毒力因子及宿主免疫應(yīng)答所介導(dǎo)的胃黏膜持續(xù)性損傷,其中的具體分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。近年來研究表明,非編碼RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs),主要是微小RNAs(microRNAs,mi RNAs)和長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs),它們作為調(diào)控性分子在眾多生物學(xué)過程及疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。但目前參與幽門螺桿菌感染致病的非編碼RNAs尚未完全發(fā)現(xiàn)且功能不明,本研究以生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等技術(shù)篩選、鑒定幽門螺桿菌感染相關(guān)非編碼RNAs,并以其中的hsa-mir-29a-3p為研究對象,探討其功能,為研究非編碼RNAs在幽門螺桿菌感染的致病機(jī)制中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。方法:1、幽門螺桿菌26695菌株與胃黏膜GES-1細(xì)胞以MOI=100:1共培養(yǎng),以炎癥指標(biāo)IL-8、COX-2的升高驗證感染模型的成立。2、基因芯片檢測幽門螺桿菌感染組和非感染對照組胃黏膜GES-1細(xì)胞編碼和非編碼基因的表達(dá)譜,并用系統(tǒng)聚類分析差異表達(dá)的編碼和非編碼基因。3、根據(jù)差異表達(dá)基因的芯片信號強(qiáng)度基于皮爾遜相關(guān)系數(shù)法構(gòu)建非編碼基因和編碼基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò);運用Gene Ontology和KEGG Pathway富集分析差異共表達(dá)的編碼基因。4、用實時熒光定量PCR技術(shù)鑒定芯片結(jié)果,初步篩選差異表達(dá)的非編碼RNAs;并在不同菌株、不同胃黏膜細(xì)胞的感染模型中鑒定非編碼RNAs的表達(dá)。5、收集臨床胃黏膜標(biāo)本;在臨床胃黏膜標(biāo)本中鑒定非編碼RNAs表達(dá);并運用ANOVA-post hoc分析差異表達(dá)非編碼RNAs與幽門螺桿菌感染相關(guān)胃黏膜病理改變之間的相關(guān)性。6、以差異表達(dá)hsa-mir-29a-3p為研究對象,qrt-pcr檢測不同感染模型及臨床標(biāo)本中hsa-mir-29a-3p的表達(dá)情況。7、轉(zhuǎn)染hsa-mir-29a-3p的模擬物/抑制劑,提取細(xì)胞總蛋白,westernblot檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥、腫瘤形成等相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)。8、利用生物信息學(xué)平臺預(yù)測hsa-mir-29a-3p潛在靶基因;構(gòu)建靶基因3’utr靶位點和突變體雙熒光素酶報告載體,與hsa-mir-29a-3p模擬物/抑制劑共轉(zhuǎn)染hek-293細(xì)胞,檢測熒光強(qiáng)度的變化,確定靶基因。9、用westernblot驗證hsa-mir-29a-3p對靶基因蛋白表達(dá)的調(diào)控以及在幽門螺桿菌感染中hsa-mir-29a-3p對靶基因蛋白表達(dá)的調(diào)控,確認(rèn)hsa-mir-29a-3p-靶基因的表達(dá)網(wǎng)絡(luò)受幽門螺桿菌感染的調(diào)控。10、用westernblot驗證hsa-mir-29a-3p靶基因在不同感染模型中的表達(dá);qrt-pcr及免疫組化實驗檢測臨床標(biāo)本中hsa-mir-29a-3p靶基因的表達(dá)情況,分析hsa-mir-29a靶基因表達(dá)是否與hsa-mir-29a-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。11、過表達(dá)或敲減胃黏膜細(xì)胞中hsa-mir-29a-3p靶基因的表達(dá),westernblot、免疫熒光、elisa等技術(shù)檢測靶基因?qū)f-κb通路的調(diào)控作用以及在幽門螺桿菌感染中hsa-mir-29a-3p靶基因?qū)f-κb通路的調(diào)控影響。結(jié)果:1、在成功構(gòu)建體外感染模型基礎(chǔ)上,芯片分析幽門螺桿菌感染的胃黏膜ges-1細(xì)胞中基因表達(dá)譜的變化,共篩選出565個差異基因和347個差異非編碼rnas(foldchange≥2或≤0.5,p0.05)。2、構(gòu)建了差異編碼基因-非編碼基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),go和keggpathway富集分析表明差異基因在細(xì)胞增殖與分化、轉(zhuǎn)移、凋亡、免疫應(yīng)答及基因轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)行注釋中以及相關(guān)信號通路中富集。3、從細(xì)胞模型和臨床標(biāo)本中篩選獲得了幽門螺桿菌感染相關(guān)的四條差異表達(dá)長鏈非編碼rnas(n345630、xloc_004787、n378726和linc00473)和三條差異表達(dá)微小rnas(hsa-mir-4500、hsa-mir-29a、hsa-mir-221)。4、xloc_004787、linc00473與幽門螺桿菌感染的慢性炎癥、腸化生密切相關(guān),hsa-mir-29a、hsa-mir-221與幽門螺桿菌感染的慢性炎癥密切相關(guān),hsa-mir-221與幽門螺桿菌感染的胃癌有相關(guān)性。5、預(yù)測并鑒定了hsa-mir-29a-3p在胃黏膜細(xì)胞中的靶基因為A20,hsa-mir-29a-3p能直接介導(dǎo)靶基因A20蛋白的表達(dá)抑制;幽門螺桿菌的感染誘導(dǎo)hsa-mir-29a-3p上調(diào)進(jìn)而調(diào)控A20蛋白的表達(dá)。6、靶基因A20在胃黏膜細(xì)胞中參與了NF-κB通路的調(diào)控;hsa-mir-29a-3p通過調(diào)控靶基因A20的表達(dá),在胃黏膜細(xì)胞中間接參與了幽門螺桿菌感染誘導(dǎo)的相關(guān)炎癥反應(yīng)。結(jié)論:1、利用高通量基因芯片技術(shù)分析篩選獲得了幽門螺桿菌感染相關(guān)的非編碼RNAs和編碼基因的差異表達(dá)譜。我們認(rèn)為分析幽門螺桿菌感染相關(guān)的非編碼RNAs的表達(dá)有助于從非編碼調(diào)控分子的角度更好了解幽門螺桿菌感染致病的機(jī)制。2、建立了幽門螺桿菌感染相關(guān)的差異編碼基因-非編碼基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步對非編碼RNAs共表達(dá)的差異編碼基因進(jìn)行GO和KEGG Pathway富集分析,為推斷幽門螺桿菌感染相關(guān)非編碼RNAs的生物學(xué)功能及潛在參與調(diào)控的信號通路奠定相關(guān)理論基礎(chǔ)。3、篩選獲得了差異表達(dá)的非編碼RNAs,與幽門螺桿菌感染相關(guān)胃黏膜疾病密切相關(guān)。4、Hsa-mir-29a-3p高表達(dá)與幽門螺桿菌的感染相關(guān);hsa-mir-29a-3p在胃黏膜細(xì)胞中的靶基因是A20;hsa-mir-29a-3p通過調(diào)控靶基因A20的表達(dá),在胃黏膜細(xì)胞中可能參與了幽門螺桿菌感染誘導(dǎo)的相關(guān)炎癥反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R573

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本文編號：1306238