本文關鍵詞：左乙拉西坦對大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)腦水腫及海馬區(qū)水通道蛋白4表達的影響及其機制探討

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【摘要】：廣義癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus)為出現(xiàn)兩次以上的癲癇發(fā)作,發(fā)作間期意識未完全恢復;或者一次癲癇發(fā)作持續(xù)30分鐘以上。癲癇持續(xù)狀態(tài)是神經(jīng)外科常見的急危重癥之一,其病死率、致殘率均較高。癲癇持續(xù)狀態(tài)可導致人或大鼠腦組織水腫(brain edema),是癲癇持續(xù)狀態(tài)的重要病理環(huán)節(jié)之一,也是導致癲癇持續(xù)狀態(tài)急性致死和致殘的重要原因。腦水腫是指液體的過度滲透和聚集而致腦組織容量增加的臨床綜合征。水通道蛋白4(AQP4)介導水分子快速跨膜轉(zhuǎn)運,在腦水腫的形成和清除中發(fā)揮關鍵作用。左乙拉西坦除抗癲癇作用外還具有抗凋亡、抑制膠質(zhì)細胞增生和減輕腦水腫等神經(jīng)保護作用。本研究旨在通過氯化鋰-匹魯卡品制作SD大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)性腦水腫模型并給以左乙拉西坦干預,研究SD大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)腦水腫的變化趨勢及海馬區(qū)水通道蛋白4的表達趨勢,分析腦水腫與AQP4是否相關。探討左乙拉西坦能否降低SD大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)腦水腫及海馬區(qū)水通道蛋白4的表達,并進一步觀察左乙拉西坦是否通過下調(diào)海馬區(qū)AQP4的表達來降低腦水腫,為左乙拉西坦減輕癲癇持續(xù)狀態(tài)性腦水腫提供理論依據(jù)。第一部分大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)腦水腫及海馬區(qū)水通道蛋白4的表達及水通道蛋白4與腦水腫的關系目的:研究SD大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)腦水腫的變化趨勢及海馬區(qū)水通道蛋白4的表達趨勢,分析腦水腫與AQP4是否相關。方法:成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠96只,體重280~320g,隨機分為2組:假手術組(SO group,n=48),癲癇持續(xù)狀態(tài)組(SE group,n=48),SO和SE組大鼠又根據(jù)癲癇持續(xù)狀態(tài)后2h,6h,12h,24h,3d,7d六個時間點隨機分為6個亞組,每組8只。SE組大鼠腹腔內(nèi)注射氯化鋰(127 mg/kg),20小時后腹腔注射匹魯卡品(25mg/kg)誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。SO組大鼠腹腔內(nèi)僅注射氯化鋰。在相應時間點,各組動物腹腔注射10%水合氯醛(0.3g/kg)麻醉后,以4%多聚甲醛心臟灌注,斷頭開顱取雙側(cè)海馬組織。右側(cè)海馬組織分為兩部分,一部分置于液氮中㧟80℃冰箱保存,用于westernblotanalysis和realtimepolymerasechainreaction(rt-pcr),另一部分用于腦水腫測量。左側(cè)海馬組織也分為兩部分,分別用于he染色和透射電鏡觀察。結(jié)果:1組織學和超微結(jié)構(gòu)觀察so組大鼠海馬ca3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常,神經(jīng)元豐富,排列整齊且密集。錐體細胞排列規(guī)則,細胞的突起和核仁明顯。se大鼠海馬ca3區(qū)正常神經(jīng)元數(shù)量減少,神經(jīng)元排列不規(guī)則,稀疏。神經(jīng)元細胞水腫變性,細胞間隙增寬,細胞突起減少,核仁模糊,胞漿淡染。膠質(zhì)細胞不同程度的增生。se組大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后2h-12h神經(jīng)元周圍間隙增寬,細胞水腫呈氣球樣變,并逐漸加重。癲癇持續(xù)狀態(tài)后24h神經(jīng)元水腫達頂峰,表現(xiàn)為空泡細胞。水腫持續(xù)到3d,較24h有所緩解,開始出現(xiàn)膠質(zhì)細胞增生和炎性細胞浸潤。癲癇持續(xù)狀態(tài)后7d細胞水腫基本消退。投射電鏡觀察so組大鼠海馬ca3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常,多為錐體形或者多角形。神經(jīng)元排列規(guī)則且緊密,染色質(zhì)均勻一致。se組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量減少,排列紊亂。神經(jīng)元的細胞漿和細胞核水腫。線粒體水腫變性,線粒體的嵴排列紊亂或斷裂,甚至缺失。2大鼠海馬區(qū)腦含水量測定與so組相比,se組在2h-12h逐漸升高(75.76±1.12,79.77±1.12,81.62±1.39,p0.05),24h達到頂峰(82.41±1.66,p0.05),3d開始下降(81.41±1.41,p0.05),7天明顯下降(77.80±0.75,p0.05),但仍高于正常。3westernblot測定海馬區(qū)aqp4的表達與so組相比,se組在2h-12h逐漸升高(0.141±0.028,0.164±0.020,0.236±0.017,p0.05),24h達頂峰(0.248±0.025,p0.05),3d開始下降(0.206±0.021,p0.05),7d后明顯下降(0.163±0.014,p0.05),但仍高于正常。4rt-pcr檢測海馬區(qū)aqp4mrna的表達與so組相比,se組在2h-12h逐漸升高(1.185±0.052,1.325±0.061,1.473±0.087,p0.05),24h達頂峰(1.636±0.055,p0.05),3d開始下降(1.441±0.080,p0.05),7d后明顯下降(1.203±0.050,p0.05),但仍高于正常。5aqp4的表達和腦水腫的關系在同一時間點,隨著腦組織aqp4的表達增高,腦組織含水量相應的升高。直線相關性分析顯示:se組aqp4蛋白,腦組織含水量,aqp4mrna表達之間呈明顯正相關(p0.05)。結(jié)論:1癲癇持續(xù)狀態(tài)后2h腦含水量和海馬區(qū)aqp4表達增加,24h達高峰,持續(xù)3d后下降,7d后接近正常。2癲癇持續(xù)狀態(tài)后aqp4蛋白、腦組織含水量、aqp4mrna表達之間呈明顯正相關。3下調(diào)aqp4蛋白表達可能是治療癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)腦水腫的一種新思路。第二部分左乙拉西坦對大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)腦水腫及海馬區(qū)水通道蛋白4表達的影響目的:探討左乙拉西坦(lev)能否降低sd大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)腦水腫,并進一步觀察左乙拉西坦是否通過下調(diào)海馬區(qū)aqp4蛋白的表達來降低腦水腫。方法:成年雄性sprague-dawley(sd)大鼠192只,體重280~320g,隨機分為4組:假手術組(sogroup,n=48),癲癇持續(xù)狀態(tài)組(segroup,n=48),左乙拉西坦低劑量組(llgroup,n=48)和左乙拉西坦低高劑量組(lhgroup,n=48)。其中se組、ll組和lh組大鼠又根據(jù)癲癇持續(xù)狀態(tài)后2h,6h,12h,24h,3d,7d六個時間點隨機分為6個亞組,每組8只。se組、ll組和lh組大鼠腹腔內(nèi)注射氯化鋰(127mg/kg),20小時后腹腔注射匹魯卡品(25mg/kg)誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。so組大鼠腹腔內(nèi)僅注射氯化鋰(127mg/kg)。其中,ll組和lh組大鼠于癲癇持續(xù)狀態(tài)后15min分別灌胃左乙拉西坦口服液100mg/kg/d、300mg/kg/d,每日一次,連續(xù)應用兩天。so組和tbi組分別灌胃等量的生理鹽水。在相應時間點,各組動物腹腔注射10%水合氯醛(0.3g/kg)麻醉后,以4%多聚甲醛心臟灌注,斷頭開顱取雙側(cè)海馬組織。右側(cè)海馬組織分為兩部分,一部分置于液氮中㧟80℃冰箱保存,用于westernblotanalysis和realtimepolymerasechainreaction(rt-pcr),另一部分用于腦水腫測量。左側(cè)海馬組織也分為兩部分,分別用于he染色和透射電鏡觀察。結(jié)果:1組織學和超微結(jié)構(gòu)觀察so組:癲癇持續(xù)狀態(tài)后2h-12h神經(jīng)元周圍間隙增寬,細胞水腫呈氣球樣變,并逐漸加重。癲癇持續(xù)狀態(tài)后24h神經(jīng)元水腫達頂峰,表現(xiàn)為空泡細胞。水腫持續(xù)到3d,較24h有所緩解,開始出現(xiàn)膠質(zhì)細胞增生和炎性細胞浸潤。癲癇持續(xù)狀態(tài)后7d細胞水腫基本消退。與so組相比,ll和lh組在各個時間點細胞水腫均減輕,表現(xiàn)為氣球樣變的細胞數(shù)量明顯減少和細胞周圍間隙縮小。與ll組相比,lh組在12h、24h、3d時間點神經(jīng)細胞水腫均減輕。se組大鼠投射電鏡超微結(jié)構(gòu)可見海馬區(qū)神經(jīng)元細胞中線粒體水腫,線粒體嵴排列紊亂或斷裂。與se組相比,ll和lh組在各個時間點線粒體水腫均減輕。與ll組相比,lh組在12h、24h、3d時間點線粒體水腫均減輕。2大鼠海馬區(qū)腦含水量測定與se組相比,ll和lh組腦含水量2h時明顯低于se(75.76±1.12,75.03±1.53,74.55±0.83),差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),ll和lh組間比較無統(tǒng)計學意義(p0.05);ll和lh組腦含水量6h時也明顯低于se組(79.77±1.12,76.83±1.67,74.88±2.43),差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),ll和lh組間比較無統(tǒng)計學意義(p0.05);12h時三組腦含水量繼續(xù)增高(81.62±1.39a,77.70±1.56,75.69±2.00),三組間比較均有統(tǒng)計學意義(p0.05);24h時腦水含量均達最高(82.41±1.66,78.49±1.59,75.94±1.47),且三組間比較均有統(tǒng)計學意義(p0.05);3d開始均下降(81.41±1.41,77.40±1.70,75.47±1.33),三組間比較仍有統(tǒng)計學意義;7d時明顯降低(77.80±0.75,75.51±2.37,74.81±0.78),ll和lh組仍稍高于se組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),但ll和lh組組間比較,無統(tǒng)計學差異(p0.05)。3westernblot測定海馬區(qū)aqp4的表達aqp4表達:與so組相比,se組、ll和lh組aqp4表達均呈上升趨勢,差別有統(tǒng)計學意義(p0.05)。ll和lh組各時間點均低于se組,以12h、24h、3d降低明顯,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與LL組相比,LH組除2h、6h和7d,其余時間點均降低,組間差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4 RT-PCR檢測海馬區(qū)AQP4 mRNA的表達AQP4 mRNA表達:SE組、LL和LH組AQP4 mRNA表達均高于SO組,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與SE組相比,LL和LH組在各時間點均低降低,均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。LL和LH組除2h、6h和7d,其余各時間點組間差別均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5 AQP4的表達和腦水腫的關系在同一時間點,隨著腦組織AQP4的表達增高,腦組織含水量相應的升高。直線相關性分析顯示:SE組、LL組和LH組AQP4蛋白,腦組織含水量,AQP4mRNA表達之間呈明顯正相關(P0.05)。結(jié)論:1癲癇持續(xù)狀態(tài)后,左乙拉西坦抑制AQP4蛋白及AQP4mRNA的表達與左乙拉西坦降低水腫腦組織含水量的趨勢基本一致。2左乙拉西坦能夠通過下調(diào)AQP4表達來減輕癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)腦水腫,其神經(jīng)保護作用在一定范圍內(nèi)存在著量-效關系。第三部分左乙拉西坦治療治療癲癇持續(xù)狀態(tài)及海馬電刺激治療頑固性顳葉癲癇的臨床療效觀察目的:探討左乙拉西坦治療癲癇持續(xù)狀態(tài)及海馬電刺激治療頑固性顳葉癲癇的療效。方法:將78例癲癇持續(xù)狀態(tài)患者隨機分為常規(guī)治療組和聯(lián)合治療組。常規(guī)治療組39例患者單獨接受丙戊酸鈉注射液治療,聯(lián)合治療組39例患者應用丙戊酸鈉注射液的同時聯(lián)合鼻飼左乙拉西坦片�；仡櫺苑治隽撕颖笔∪嗣襻t(yī)院功能神經(jīng)外科利用海馬電刺激治療頑固性顳葉癲癇患者。結(jié)果:常規(guī)治療組的總體有效率為61.5%,而聯(lián)合治療組的總體有效率為87.2%,差異具有統(tǒng)計學意義。海馬電刺激使癲癇發(fā)作總體減少93%。結(jié)論:左乙拉西坦聯(lián)合丙戊酸鈉治療癲癇持續(xù)狀態(tài)有效。海馬電刺激治療頑固性顳葉癲癇有效。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742.1

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