本文關(guān)鍵詞：TBHQ改善壓力超負(fù)荷小鼠心肌重構(gòu)的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景心力衰竭是一種對(duì)病人生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響,大量占用社會(huì)醫(yī)療資源,致死致殘率高,預(yù)后差的嚴(yán)重心臟疾病。在持續(xù)性超負(fù)荷或心肌梗死等應(yīng)激情況下,心臟發(fā)生心肌肥厚,這被認(rèn)為是一種適應(yīng)性反應(yīng),并對(duì)心臟泵功能異常具有代償作用；然而,應(yīng)激因素持續(xù)存在將導(dǎo)致心臟失代償,心腔擴(kuò)大、心肌纖維化、氧化應(yīng)激、收縮功能異常,最終發(fā)生心力衰竭。目前,從代償性心肌肥厚發(fā)展到心力衰竭的具體機(jī)制還不是完全清楚。大量證據(jù)表明,心肌細(xì)胞丟失(凋亡和/或壞死)、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、失控的心肌纖維化等在這種病理過程中可能發(fā)揮重要作用,這些均可以作為抑制心力衰竭發(fā)展的潛在治療靶點(diǎn)。雖然對(duì)此進(jìn)行了廣泛的研究,但是目前我們?nèi)匀狈τ行У闹委煼椒ㄒ砸种菩募∈Т鷥敽托牧λソ叩陌l(fā)生、發(fā)展。叔丁基對(duì)苯二酚(Tert-butylhydroquinone, TBHQ)是一種合成酚類抗氧化劑,被用于抑制脂質(zhì)過氧化。目前認(rèn)為,TBHQ是有效的Nrf2激活劑。Nrf2是一種與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Ⅱ相解毒反應(yīng)相關(guān)的氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子。在應(yīng)激情況下,被激活的Nrf2介導(dǎo)一系列細(xì)胞保護(hù)酶表達(dá),包括：苯醌還原酶(NQO1)、谷胱甘肽過氧化物酶、血紅蛋白氧化酶-1(HO-1)、超氧化物歧化酶等等。大量體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),TBHQ對(duì)于各種病理狀態(tài)下的器官具有顯著的細(xì)胞保護(hù)活性。例如,TBHQ在腦外傷、缺血性中風(fēng)和蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锬Ｐ椭芯哂猩窠?jīng)保護(hù)作用。同樣,有證據(jù)表明,TBHQ處理可以抑制大鼠缺血再灌注(Ischemia-Reperfusion,I/R)損傷引起的腎臟損害和氧化應(yīng)激。TBHQ的上述神經(jīng)保護(hù)和腎臟保護(hù)作用都是由Nrf2抗氧化系統(tǒng)介導(dǎo)的。新近的一項(xiàng)研究提示TBHQ在病理狀況下可能有心肌保護(hù)作用。然而,TBHQ對(duì)病理性心肌重構(gòu)的影響,特別是其可能的作用機(jī)制,尚缺乏系統(tǒng)的評(píng)價(jià)研究。因此,在以下的研究中我們檢測了TBHQ對(duì)壓力超負(fù)荷引起的心肌重構(gòu)的影響,并初步探討了TBHQ在心肌保護(hù)作用中的可能機(jī)制。研究目的1.研究TBHQ對(duì)壓力超負(fù)荷小鼠心肌重構(gòu)過程的影響2.研究TBHQ改善壓力超負(fù)荷心肌重構(gòu)的可能機(jī)制研究方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組8周齡雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華公司。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。10～12周齡的雄性小鼠被選擇進(jìn)入實(shí)驗(yàn)研究,隨機(jī)分為8組：假手術(shù)組(Sham)、主動(dòng)脈縮窄組(TAC)、Sham+TBHQ組、TAC+TBHQ組、TAC+Rapamycin組、TAC+Rapamycin+TBHQ組、TAC+Ly294002組、TAC+Ly294002+TBHQ組。2.動(dòng)物模型建立利用改良的主動(dòng)脈縮窄法建立心臟壓力超負(fù)荷動(dòng)物模型。腹腔注射0.8%戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉小鼠,在胸骨上切跡水平做一水平切口,確定氣管位置,縱向切口胸骨,暴露主動(dòng)脈弓。于無名動(dòng)脈和左頸動(dòng)脈間,將27號(hào)針頭與主動(dòng)脈弓一起結(jié)扎后,抽出針頭,逐層縫合組織。假手術(shù)組的手術(shù)步驟同前,但不結(jié)扎主動(dòng)脈弓。3.超聲心動(dòng)圖檢測分別在建立小鼠TAC模型前1天及術(shù)后2周、4周進(jìn)行心臟超聲心動(dòng)圖檢測。1～2%異氟烷吸入麻醉,選取頻率為35MHz的超聲探頭進(jìn)行心臟大小和功能參數(shù)的采集,采用高分辨率超聲Vevo770系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。左室長軸和短軸切面記錄超聲圖像。M型超聲檢測左室舒張末內(nèi)徑、左室收縮末內(nèi)徑、舒張末室間隔厚度、舒張末左室后壁厚度。左室短軸縮短率、射血分?jǐn)?shù)和校正的左室質(zhì)量由超聲系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算。4.組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)小鼠心臟灌注固定5分鐘,留取實(shí)驗(yàn)小鼠心臟標(biāo)本,4%多聚甲醛固定過夜,脫水,石蠟包埋。于心臟短軸切面乳頭肌水平,制作5μm厚組織切片。組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining), Masson染色及天狼猩紅染色。采用免多克隆抗體進(jìn)行4-HNE的特異性免疫組織化學(xué)染色。5.羥脯氨酸檢測用羥脯氨酸法檢測小鼠左室組織的膠原含量,按照南京建成生物公司的羥脯氨酸檢測試劑盒所提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。6.蛋白質(zhì)免疫印跡用裂解液裂解左室組織并提取總蛋白,SDS-PAGE電泳恒壓分離蛋白樣品,以濕式轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉封閉后用特異性一抗4℃孵育過夜,隨后室溫孵育二抗2小時(shí)。ECL化學(xué)發(fā)光液使目的蛋白條帶顯影,并用LAS-4000化學(xué)發(fā)光儀檢測。7.蛋白質(zhì)羰基化檢測按照既往文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)步驟并加以改進(jìn),檢測左室組織的蛋白質(zhì)羰基化水平。8. TUNEL染色使用TUNEL染色檢測心肌組織內(nèi)細(xì)胞凋亡,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)400×視野計(jì)數(shù)TUNEL陽性的細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)。9.實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)依照Taqman Gene Expression primer-probe試劑盒提供的方法進(jìn)行Real-timePCR,以18S RNA作為管家基因,相對(duì)定量的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。10.Akt酶活性和Nrf2活性檢測Akt酶活性檢測按照Akt酶檢測試劑盒(CST)提供的步驟進(jìn)行。按照AM Nrf2試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟檢測心室組織核蛋白的Nrf2-ARE結(jié)合水平。11.肝臟組織血紅蛋白含量檢測肝臟組織血紅蛋白含量檢測按照Drabkin's試劑盒(Sigma)提供的實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行。12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析定量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,選用SPSS13.0軟件以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析及Newman-Keuls檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù),P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1.TBHQ降低TAC導(dǎo)致的死亡率TBHQ處理降低了TAC導(dǎo)致的死亡率2. TBHQ抑制TAC誘導(dǎo)的小鼠左室擴(kuò)張和收縮功能異常我們首先描述了壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展過程。依據(jù)心臟超聲檢測結(jié)果,TAC術(shù)后2周小鼠的左心室壁顯著增厚,但左心室腔維持正常,即發(fā)生代償性心肌肥厚。TAC術(shù)后4周發(fā)生失代償性心肌肥厚、心力衰竭,左心室腔擴(kuò)張,心室壁變薄。我們觀察到,TBHQ處理抑制了TAC引起的左心室擴(kuò)張及心室壁變薄。2周時(shí)TAC組和Sham組小鼠的射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮短率(FS)無顯著差異,然而,4周時(shí)TAC組的EF和FS顯著降低。TBHQ處理逆轉(zhuǎn)了TAC引起的EF和FS的損害。另外,我們發(fā)現(xiàn)4周時(shí)TAC組的肺臟重量較Sham組顯著增加,這表明TAC組發(fā)生了充血性心力衰竭的體征,而TBHQ處理顯著改善了肺淤血。利用Drabkin's試劑檢測了實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟血紅蛋白含量即肝淤血指征,TAC組肝臟血紅蛋白含量較Sham組顯著升高,而TBHQ處理顯著降低肝臟血紅蛋白含量。3. TBHQ對(duì)TAC誘導(dǎo)的心肌肥厚和纖維化無顯著影響組織形態(tài)學(xué)分析表明TAC導(dǎo)致典型的心肌肥厚。然而,TBHQ處理對(duì)于TAC誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚無顯著影響。與此相一致,心臟超聲數(shù)據(jù)表明TBHQ處理維持了TAC術(shù)后小鼠的心肌肥厚表型。TAC術(shù)后4周,TAC組心臟重量/體重比值、心臟重量/脛骨長度比值以及超聲測量計(jì)算的左室重量/脛骨長度比值較Sham組均顯著增加。然而,TBHQ處理并未影響心臟重量/脛骨長度比值和超聲測量計(jì)算的左室重量/脛骨長度比值,僅僅使心臟重量/體重比值輕度降低。TAC組的ANP和BNP的mRNA表達(dá)水平顯著升高,而TBHQ處理顯著增加了這兩者的表達(dá)水平。利用Masson染色、天狼猩紅染色和羥脯氨酸檢測,我們對(duì)心肌纖維化的程度也進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,TBHQ處理并不影響TAC引起的心肌纖維化程度。4. TBHQ并未激活Nrf2、AMPK,也未抑制ER應(yīng)激檢測左室組織中的Nrf2蛋白表達(dá)水平后,我們驚奇地發(fā)現(xiàn),在本實(shí)驗(yàn)中TBHQ組小鼠心肌組織內(nèi)的Nrf2蛋白并沒有增加。為了證實(shí)這一結(jié)果,我們又檢測了左心室組織核蛋白中的Nrf2 DNA結(jié)合活性,其在各實(shí)驗(yàn)組間也沒有差異。另外,我們檢測了Nrf2靶基因NQO1、HO-1、glutathione peroxidase-1、和thioredoxin的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示,TBHQ未能顯著改變左心室組織Nrf2靶基因的表達(dá)水平。但是,TBHQ卻使小鼠肝腎組織的Nrf2靶基因表達(dá)水平顯著升高。另外,我們還發(fā)現(xiàn)心臟組織AMPKa的磷酸化水平未受TBHQ影響。而且,TBHQ處理亦未顯著影響ER應(yīng)激標(biāo)志CHOP和GRP78的mRNA表達(dá)水平。5. TBHQ抑制心肌細(xì)胞凋亡通過心臟左室組織切片的TUNEL染色,我們觀察到,TAC組心肌細(xì)胞凋亡水平較Sham組顯著增加了近10倍。TBHQ處理顯著抑制TAC導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡水平近60%。6. TBHQ激活A(yù)kt信號(hào)通路通過蛋白質(zhì)免疫印跡法,我們發(fā)現(xiàn)TBHQ處理組Akt磷酸化水平較Sham組和TAC組顯著升高。與此相一致,TBHQ處理顯著升高Bad磷酸化水平。相反,ERK1/2磷酸化水平并未受TBHQ影響。我們直接檢測了心肌組織中的Akt酶活性,TBHQ處理組的Akt酶活性較TAC組顯著增高。而且,TBHQ處理組的Akt底物GSK-3β和mTOR蛋白磷酸化水平亦顯著增高。為了闡明TBHQ激活A(yù)kt是否具有亞型特異性,我們又檢測了Akt1和Akt2的磷酸化水平,結(jié)果顯示TBHQ處理組的Akt1和Akt2的磷酸化水平均顯著增高。7.阻斷Akt通路后TBHQ對(duì)心肌重構(gòu)的影響TAC術(shù)后2周,TAC+LY294002組的左室收縮功能顯著降低,心肌肥厚被顯著抑制。但是,TBHQ并不能改善TAC+LY294002組的心功能異常。TAC組心肌組織中的p-Akt水平較Sham組顯著升高。另外,Sham組和TAC組的心肌細(xì)胞凋亡水平無顯著差異。與TAC組比較, TAC+LY294002組心肌組織的p-Akt水平顯著降低,細(xì)胞凋亡水平顯著增加。而TBHQ并未能逆轉(zhuǎn)這一變化。TAC術(shù)后2周, TAC+Rapamycin組的心肌肥厚指標(biāo)較TAC組顯著降低。TAC術(shù)后4周,TAC+Rapamycin組的FS和EF值較TAC組有所改善。同時(shí),TBHQ可以進(jìn)一步改善TAC+Rapamycin組的左室收縮功能。8. TBHQ抑制心肌細(xì)胞中4-HNE和蛋白質(zhì)羰基化水平為了證明TBHQ是否具有抗氧化效應(yīng),我們進(jìn)行了免疫組化染色,TAC顯著增加心肌組織中活性醛類4-HNE的表達(dá),而TBHQ處理使其表達(dá)水平顯著降低。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法,我們發(fā)現(xiàn)TAC組心肌組織中的羰基化蛋白豐度顯著升高,而TBHQ處理顯著抑制TAC誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化水平。結(jié)論1.TBHQ顯著改善壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)2. TBHQ可能通過減少心肌細(xì)胞凋亡并抑制活性醛產(chǎn)生,從而抑制心力衰竭進(jìn)展,但與Nrf2抗氧化系統(tǒng)無關(guān)3. TBHQ抑制心肌細(xì)胞凋亡作用可能由Akt磷酸化介導(dǎo)研究背景我們之前的研究表明,叔丁基對(duì)苯二酚(tert-butylhydroquinone, TBHQ)在心肌重構(gòu)過程中可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮心臟保護(hù)作用,并且Akt通路的激活可能參與介導(dǎo)這種作用。但是其細(xì)胞水平的具體機(jī)制尚待闡明。TBHQ是一種合成酚類抗氧化劑,由于其具有強(qiáng)抗脂質(zhì)過氧化活性而被廣泛用于食物存儲(chǔ)。大量研究證實(shí),TBHQ通過抗氧化、抗炎癥和抗凋亡等發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。4-羥基壬烯醛(4-Hydroxynonenal)是一種主要的脂質(zhì)過氧化終末產(chǎn)物。4-HNE做為一種氧化應(yīng)激(oxidative stress)的誘導(dǎo)劑,與包括阿爾茨海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注、肥胖、糖尿病等多種氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的病理過程相關(guān)。目前,越來越多的證據(jù)表明,4-HNE是一種重要的信號(hào)小分子,在細(xì)胞周期、基因表達(dá)、細(xì)胞過程調(diào)控的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。最近研究表明,4-HNE還可以通過多種信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。受體酪氨酸激酶(RTKs)是配體結(jié)合的跨膜蛋白,可以將細(xì)胞外環(huán)境信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi),激活信號(hào)通路,導(dǎo)致粘附、遷移,增殖、分化,存活、凋亡各種反應(yīng)。進(jìn)而,RTKs的活性、豐度、細(xì)胞分布及調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致眾多疾病的發(fā)生。胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)屬于RTKs。IGF-1R與其配體胰島素樣生長因子-1(IGF-1)結(jié)合后激活包括PI3K/AKT信號(hào)通路在內(nèi)的眾多細(xì)胞磷酸化級(jí)聯(lián)通路,在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生物功能。我們?cè)诖瞬糠盅芯縏BHQ是否可能通過IGF-1R/PI3K/AKT信號(hào)通路參與調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡作用。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)是生物體內(nèi)廣泛存在的催化磷酸化酪氨酸殘基(pTyr)脫磷酸的酶,PTP可作為RTK的負(fù)性調(diào)控因子與RTKs共同作用精細(xì)調(diào)控細(xì)胞的內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化水平。PTPlB是經(jīng)典的蛋白酪氨酸特異PTP,是一種重要的胰島素信號(hào)負(fù)調(diào)控蛋白。PTEN是另一種重要的Akt通路負(fù)性調(diào)控因子,與PI3K/Akt、MAPK、FAK等多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控有關(guān)。在本研究中,我們還試圖探究TBHQ是否可能通過PTP1B或PTEN參與對(duì)RTKs的調(diào)控。研究目的1.研究TBHQ在心肌細(xì)胞水平對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)作用2.研究PI3K/Akt信號(hào)通路在TBHQ抗心肌細(xì)胞凋亡中的作用3.探索TBHQ激活PI3K/Akt信號(hào)通路的機(jī)制,明確RTK信號(hào)通路是否參與其中研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞系購自于ATCC公司,培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中,在5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長至融合時(shí),用適量胰酶(0.25%)消化細(xì)胞進(jìn)行傳代,第3到6代之間的H9c2用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。依據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道的方法,選取1～2天的SD大鼠乳鼠提取原代心肌細(xì)胞。用膠原酶消化心臟組織。離心后收集細(xì)胞,種板培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。置于細(xì)胞孵育箱內(nèi)孵育2小時(shí),棄去貼壁的成纖維細(xì)胞,種板培養(yǎng)基重懸上層心肌細(xì)胞,置于膠原涂層的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2～3天后,更換培養(yǎng)基為維持培養(yǎng)基繼而進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.細(xì)胞活力檢測用MTT法檢測TBHQ和4-HNE對(duì)H9c2細(xì)胞活力的影響。以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)H9c2細(xì)胞,每孔加入1ml含TBHQ和4-HNE的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后,每孔加入200μl MTT (5mg/ml)孵育2小時(shí)后再加入200μlDMSO。24孔培養(yǎng)板離心1800×g,5min,4℃。酶標(biāo)儀測各孔540nm吸光度值。以DMSO處理細(xì)胞為對(duì)照(100%)計(jì)算細(xì)胞活力(%)。3.蛋白質(zhì)免疫印跡經(jīng)裂解液裂解細(xì)胞后迅速提取細(xì)胞總蛋白,SDS-PAGE電泳恒壓分離蛋白樣品,以濕式轉(zhuǎn)膜法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后以特異性一抗4℃孵育過夜,隨后室溫孵育二抗2小時(shí)。用ECL化學(xué)發(fā)光液使目的蛋白條帶顯影,并用LAS-4000化學(xué)發(fā)光儀檢測。4. Caspase3/7活性測定經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞內(nèi)加入Caspase-Glo 3/7試劑以檢測細(xì)胞的Caspase3/7活性。繼而將加入檢測試劑的樣品迅速轉(zhuǎn)移至白色96孔板中,讀板測定發(fā)光。5. TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡使用TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析定量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,選用SPSS13.0軟件以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析及Newman-Keuls檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù),P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.TBHQ對(duì)心肌細(xì)胞活力無影響我們觀察到,5、10、20、40μM TBHQ對(duì)心肌細(xì)胞活力無影響2. TBHQ引起H9c2細(xì)胞的Akt磷酸化用不同濃度的TBHQ處理H9c2細(xì)胞24小時(shí),發(fā)現(xiàn)TBHQ在10μM到40μM濃度范圍內(nèi)引起明顯的Akt活性增加,而1μM TBHQ對(duì)Akt并無影響。用20μM的TBHQ刺激H9c2細(xì)胞不同時(shí)間,發(fā)現(xiàn)TBHQ自1小時(shí)開始就顯著增加Akt磷酸化水平,但隨TBHQ作用時(shí)間延長,Akt的磷酸化水平并無增高趨勢(shì)。3.4-HNE抑制心肌細(xì)胞活性并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡我們觀察到,與對(duì)照比較,10μM或20μM的4-HNE對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響,自40μM以上的4-HNE呈劑量依賴性顯著降低細(xì)胞活力。我們還觀察到,與對(duì)照比較,10μM的4-HNE對(duì)caspase 3/7活性無顯著影響,自20μM以上的4-HNE呈劑量依賴性顯著增強(qiáng)caspase 3/7活性。4. TBHQ抑制4-HNE引起的心肌細(xì)胞凋亡我們用TUNEL染色的方法觀察到,TBHQ能顯著抑制4-HNE引起的H9c2細(xì)胞凋亡。5. TBHQ通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制4-HNE引起的細(xì)胞凋亡我們發(fā)現(xiàn),TBHQ抑制4-HNE誘導(dǎo)的caspase 3裂解,同時(shí)伴有Akt磷酸化增強(qiáng)。TBHQ的抗凋亡效應(yīng)可以被PI3K的抑制劑wortmannin或Akt的抑制劑Akti抑制。為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)免疫印跡的結(jié)果,我們又檢測了caspase3/7活性,并發(fā)現(xiàn)TBHQ可以抑制4-HNE引起的caspase3/7激活,TBHQ的這一效應(yīng)同樣可以被wortmannin或Akti抑制。6. TBHQ抑制4-HNE引起的原代心肌細(xì)胞凋亡Western blot結(jié)果顯示,4-HNE存在與否并不影響TBHQ對(duì)原代心肌細(xì)胞激活A(yù)kt的效應(yīng)。TBHQ也可以抑制4-HNE誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞caspase 3/7激活。而且,在促心肌肥厚因子內(nèi)皮素-1存在的情況下,TBHQ仍然對(duì)原代心肌細(xì)胞具有抗凋亡作用。7. PTP1B和PTEN抑制劑對(duì)TBHQ磷酸化Akt的影響我們發(fā)現(xiàn),PTP1B抑制劑顯著增加H9c2細(xì)胞的Akt磷酸化水平,然而,存在PTP1B制劑的條件下,TBHQ并沒有進(jìn)一步增加Akt磷酸化水平。我們還發(fā)現(xiàn),PTEN抑制劑顯著增加H9c2細(xì)胞的Akt磷酸化水平,然而,存在PTEN抑制劑的條件下,TBHQ仍可以進(jìn)一步增加Akt磷酸化水平。8. TBHQ對(duì)蛋白酪氨酸磷酸化水平的影響我們發(fā)現(xiàn),在5μM到40μM濃度范圍內(nèi),TBHQ顯著增加H9c2細(xì)胞的蛋白酪氨酸磷酸化水平。9. TBHQ對(duì)IGF-1R磷酸化水平的影響我們發(fā)現(xiàn),在10μM到40μM濃度范圍內(nèi),TBHQ顯著增加H9c2細(xì)胞的IGF-1R磷酸化水平。結(jié)論1.TBHQ具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用,這種作用是PI3K/Akt通路介導(dǎo)的2.我們的結(jié)果提示TBHQ對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活作用可能與PTP1B的抑制和IGF-1R信號(hào)通路活性增加有關(guān)研究背景在前兩章的研究中,我們發(fā)現(xiàn)叔丁基對(duì)苯二酚(Tert-butylhydroquinone, TBHQ)在心肌組織和細(xì)胞中顯著激活了PI3K/Akt信號(hào)系統(tǒng),并在壓力超負(fù)荷引起的心肌重構(gòu)中發(fā)揮心臟保護(hù)作用。Akt是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,亦被稱為蛋白激酶B (protein kinase B, PKB),與細(xì)胞代謝、存活、遷移和基因表達(dá)等多種細(xì)胞功能相關(guān)。研究證明,Akt功能失調(diào)與多種人類疾病相關(guān),包括：癌癥、糖尿病、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。Akt的活化在不同的組織中可能造成相反的結(jié)果。在某些情況下激活A(yù)kt可以起到細(xì)胞保護(hù)作用,而在另外一些情況下Akt的過度或長期激活也可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形成。因此,搞清楚TBHQ在不同組織中對(duì)Akt活性調(diào)節(jié)的藥理作用十分必要。而這方面尚缺乏系統(tǒng)的比較研究。因此,在以下研究中,我們給予小鼠TBHQ整體干預(yù)后,比較了TBHQ在不同組織中對(duì)Akt的藥理作用,發(fā)現(xiàn)TBHQ的藥理作用具有組織差異性。同時(shí)在體外觀察TBHQ在非心肌細(xì)胞中對(duì)Akt的影響。研究目的1. TBHQ對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和3T3成纖維細(xì)胞中Akt活性的影響2. TBHQ在整體水平對(duì)正常肝臟、腎臟、腦和主動(dòng)脈組織中Akt活性的影響研究方法1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和3T3細(xì)胞的培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和3T3成纖維細(xì)胞購自于ATCC公司。分別培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中,在5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和3T3成纖維細(xì)胞生長至融合時(shí),用胰酶(0.25%)消化細(xì)胞進(jìn)行傳代,第3至6代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和3T3成纖維細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.動(dòng)物分組8周齡雄性C57BL/6小鼠購自于北京維通利華公司。全部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。選擇10～12周齡的雄性小鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)研究,隨機(jī)分為2組：對(duì)照組、TBHQ組。3.蛋白質(zhì)免疫印跡經(jīng)裂解液分別裂解組織和細(xì)胞后,迅速提取組織和細(xì)胞總蛋白,SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品,以電轉(zhuǎn)移法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后以特異性一抗孵育過夜,隨后室溫孵育二抗。用ECL化學(xué)發(fā)光液使目的蛋白條帶顯影,并用LAS-4000化學(xué)發(fā)光儀檢測。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析定量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,選用SPSS13.0軟件以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析及Newman-Keuls檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù),P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1. TBHQ對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Akt磷酸化的影響用濃度為1、10、50μM的TBHQ分別處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí),用TBHQ的溶劑DMSO作為對(duì)照處理細(xì)胞,用western blot的方法檢測TBHQ對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn),隨TBHQ藥物濃度增加,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的磷酸化Akt表達(dá)水平逐漸升高。2. TBHQ對(duì)3T3細(xì)胞Akt磷酸化的影響用濃度為1、10、50μM的TBHQ分別處理3T3成纖維細(xì)胞24小時(shí),用TBHQ的溶劑DMSO作為對(duì)照處理細(xì)胞,用western blot的方法檢測TBHQ對(duì)3T3成纖維細(xì)胞Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn),隨TBHQ藥物濃度增加,3T3細(xì)胞的磷酸化Akt表達(dá)水平逐漸升高。3. TBHQ對(duì)肝臟組織Akt磷酸化的影響用western blot的方法檢測TBHQ對(duì)肝臟組織Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn),TBHQ使肝臟組織中的磷酸化Akt水平顯著增加。4. TBHQ對(duì)腎臟組織Akt磷酸化的影響用western blot的方法檢測TBHQ對(duì)腎臟組織Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn),TBHQ使腎臟組織中的磷酸化Akt水平顯著增加。5. TBHQ對(duì)主動(dòng)脈組織Akt磷酸化的影響用western blot的方法檢測TBHQ對(duì)主動(dòng)脈組織Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn),TBHQ使主動(dòng)脈組織中的磷酸化Akt水平顯著增加。6. TBHQ對(duì)腦組織Akt磷酸化的影響用western blot的方法檢測TBHQ對(duì)腦組織Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn),TBHQ并未影響腦組織中的Akt磷酸化水平。結(jié)論1. TBHQ可以激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和3T3成纖維細(xì)胞中的Akt2. TBHQ整體干預(yù)可以激活小鼠肝臟、腎臟、主動(dòng)脈組織中的Akt3. TBHQ整體干預(yù)未能激活小鼠腦組織中的Akt
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.6

【共引文獻(xiàn)】

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4 盧新U，

本文編號(hào)：1301232