本文關(guān)鍵詞：電針上巨虛和天樞調(diào)節(jié)腸運動的局部腸神經(jīng)機(jī)制研究

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【摘要】：目的:基于腸神經(jīng)形態(tài)與功能異常的小鼠便秘動物模型,探究電針上巨虛和天樞調(diào)節(jié)腸運動的效應(yīng)差異,并觀察腸神經(jīng)標(biāo)志物及腸道內(nèi)不同類型神經(jīng)元的變化情況,分析電針對腸運動調(diào)節(jié)的局部腸神經(jīng)機(jī)制,為針灸治療相關(guān)疾病的提供科學(xué)基礎(chǔ)。方法:第一部分:小鼠便秘模型制作的方法。采用3周齡雄性C57BL/6J小鼠,體重20-25g,隨機(jī)分為3組,冷飲刺激A組,正常飼養(yǎng)B組和溫飲刺激C組。所有實驗動物隨機(jī)分于單籠并標(biāo)記號碼,正常飼食、飲水。單籠盒內(nèi)置鐵絲網(wǎng)緊貼于墊料之上,用于隔離糞便易于收集。為了減少實驗動物本身生物節(jié)律的干擾,在固定時間段即每日上午9:00開始干預(yù)刺激。A組給予0-4℃生理鹽水,首次0.2 ml/只,為防止實驗動物機(jī)體適應(yīng)刺激,每5d后多0.05 ml/只,實驗周期一共2周。B組,不給予灌胃,正常飼養(yǎng)。C組灌胃給予15-20℃生理鹽水,其余同A組。停止灌胃后,各組繼續(xù)正常飼養(yǎng),觀察6d,直至20d結(jié)束。實驗周期內(nèi),觀察糞便性狀和重量改變,以及腸動力的變化。第二部分:基于上述便秘模型,篩選出便秘的小鼠。在觀察首粒排便時間中,便秘小鼠隨機(jī)分為三組,即模型組、上巨虛組和天樞組,相同數(shù)量的正常小鼠,設(shè)為正常組。電針參數(shù)為2/15 Hz,lmA,實驗針刺時間為15 min/d,共3d。重復(fù)制作模型方法,在記錄腸內(nèi)壓電生理實驗中,選取便秘小鼠和正常小鼠,將自制水囊測壓頭放置于小鼠近端結(jié)腸或遠(yuǎn)端結(jié)直腸,經(jīng)壓力換能器轉(zhuǎn)化后測定近端結(jié)腸或遠(yuǎn)端直結(jié)腸的腸內(nèi)壓,在波形出現(xiàn)后待其持續(xù)且穩(wěn)定,先保存一段為基線參考數(shù)值,再隨機(jī)順序進(jìn)行電針刺激,干預(yù)完成后待基線重新穩(wěn)定方可進(jìn)行下一個穴位的針刺,電針參數(shù)同上,時間為1 min。通過不同實驗,分析上巨虛和天樞對便秘模型產(chǎn)生的效應(yīng)差異以及差異部位。第三部分:不同批次重復(fù)制作模型及分組過程,便秘小鼠隨機(jī)分為三組,即模型組、上巨虛組和天樞組,相同數(shù)量的正常小鼠,設(shè)為正常組。給予上述電針參數(shù)干預(yù)3d后,禁食12h取下近端結(jié)腸組織。通過免疫組化(immunohistochemistry)、實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和免疫印跡(Western Blot,WB)檢測腸神經(jīng)標(biāo)志物PGP 9.5和膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物ChAT、氮能神經(jīng)元標(biāo)志物nNOS表達(dá)水平的變化,分析上巨虛和天樞產(chǎn)生效應(yīng)差異的腸神經(jīng)機(jī)制。結(jié)果:第一部分:在持續(xù)給予冷飲刺激14d后,小鼠出現(xiàn)不同的機(jī)體狀態(tài),其中狀態(tài)Ⅲ表現(xiàn)出便秘癥狀且在停止干預(yù)后穩(wěn)定存在6d以上。在持續(xù)干預(yù)過程中,可依據(jù)9-14d糞便重量及糞便性狀的變化,篩選出狀態(tài)Ⅲ小鼠即便秘動物模型。第二部分:上巨虛和天樞,對小鼠便秘狀態(tài)都有治療作用,緩解便秘癥狀,但二者效應(yīng)并不完全一致,在首粒排出指示劑實驗中,上巨虛恢復(fù)排便時間至正常水平,天樞雖有作用但未能恢復(fù)至正常。在糞便重量和性狀方面,雖無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,但天樞組小鼠糞便平均重量仍低于正常小鼠和上巨虛組小鼠。此外,在腸內(nèi)壓實驗中,在遠(yuǎn)端結(jié)直腸部位,上巨虛和天樞均能提高腸內(nèi)壓(促進(jìn)腸運動),在近端結(jié)腸部位,上巨虛仍能提高腸內(nèi)壓(促進(jìn)腸運動),而天樞無效應(yīng)。第三部分:免疫組化結(jié)果表明上巨虛對便秘小鼠近端結(jié)腸ENS有調(diào)節(jié)作用,而天樞無明顯作用。此外,qPCR和Western Blot結(jié)果顯示上巨虛可以下調(diào)高表達(dá)的氮能神經(jīng)元標(biāo)志物nNOS至正常水平,同時上調(diào)低表達(dá)的膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物ChAT至正常水平,而天樞只能下調(diào)高表達(dá)的氮能神經(jīng)元標(biāo)志物nNOS至正常水平。結(jié)論:1通過冷飲刺激,可以在不依賴藥物的狀態(tài)下誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)便秘癥狀,且可穩(wěn)定持續(xù)一段時間,持續(xù)的冷飲刺激會引起腸神經(jīng)形態(tài)和功能出現(xiàn)異常。2上巨虛和天樞都可以緩解便秘癥狀,但二者在改變便秘小鼠的糞便重量、糞便性狀和腸道功能上效應(yīng)并不完全一致。在便秘小鼠的遠(yuǎn)端結(jié)直腸部位,二者均具有促進(jìn)作用,而在便秘小鼠的近端結(jié)腸部位,上巨虛具有促進(jìn)作用,天樞無明顯作用。3在便秘小鼠近端結(jié)腸,上巨虛對ENS有調(diào)節(jié)作用,而天樞無明顯作用。上巨虛和天樞通過影響ENS中不同類型的神經(jīng)元產(chǎn)生效應(yīng)差異。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R245

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本文編號：1299153