本文關(guān)鍵詞：Klotho對血小板生成及功能的調(diào)控作用與機制研究

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【摘要】：血小板在生理病理過程中發(fā)揮著非常重要的作用。血小板最主要的功能是參與凝血和止血。當(dāng)體內(nèi)血小板水平顯著降低時,如急性放射病,會導(dǎo)致機體出血和感染;相反,當(dāng)血小板水平過高或血小板過度活化時,則會引發(fā)血栓性疾病。血小板是由骨髓中的巨核細胞產(chǎn)生。血小板的生成經(jīng)歷了造血干細胞定向分化為巨核細胞、巨核祖細胞擴增、巨核細胞分化成熟、多倍體形成、向血管竇的遷移及與內(nèi)皮細胞的粘附、向血管竇伸出血小板前體及血小板產(chǎn)生和釋放等階段。我們前期研究發(fā)現(xiàn),巨核細胞生成血小板受到微環(huán)境中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平調(diào)控。值得關(guān)注的是,ROS也是電離輻射損傷的主要介導(dǎo)因子,電離輻射可以誘導(dǎo)ROS大量產(chǎn)生,通過與細胞生物大分子結(jié)合而氧化損傷細胞,從而導(dǎo)致細胞凋亡或壞死。電離輻射后外周血細胞的大幅度降低與骨髓內(nèi)造血細胞大量凋亡壞死有關(guān)。血小板減少是骨髓放射損傷后的主要表現(xiàn)之一,也是導(dǎo)致機體出血、感染乃至死亡的重要原因。因此,阻斷電離輻射誘導(dǎo)的巨核祖細胞凋亡可以預(yù)防或減輕電離輻射后血小板減少癥的發(fā)生,防治出血及感染。Klotho是一種主要由腎小管上皮細胞合成分泌的抗衰老蛋白。作為一種激素樣蛋白,Klotho能夠通過血液循環(huán)到達全身組織臟器,從而發(fā)揮廣泛抗衰老作用。Klotho抗衰老作用與其強大的抑制活性氧生成及清除活性氧能力有關(guān)。研究證實,Klotho可以有效預(yù)防氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞和腎細胞凋亡。由于正常情況下血小板的生成及放射損傷所致血小板減少都與氧化應(yīng)激有關(guān),所以,Klotho是否能夠參與血小板的生成調(diào)控和防治放射損傷引起的血小板減少,值得深入研究。另一方面,ROS在血小板活化過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。除了外源性ROS,血小板內(nèi)的ROS及其下游信號通路在血小板激活、血小板與血管壁的粘附、血小板的募集與聚集及血栓形成中發(fā)揮重要的作用。某些疾病情況下,血小板異常活化常常會增加血栓形成的風(fēng)險,從而導(dǎo)致缺血性疾病如心肌梗死、腦卒中的發(fā)生。但是,目前預(yù)防血小板活化和血栓形成的有效措施有限。研究證實,Klotho水平和功能與血栓形成疾病的發(fā)病風(fēng)險呈高度負(fù)相關(guān),同時,以血液循環(huán)中Klotho水平嚴(yán)重降低為特征的疾病-慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)常常并發(fā)血小板功能改變,提示Klotho*本課題受國家自然科學(xué)基金(81270290;81500087;81573084)資助作為一種抗氧化劑也可能會影響血小板的活化過程。因此,為了探討Klotho對血小板生成與功能的影響及其病理生理學(xué)意義,在本研究中,我們以人原代巨核細胞和人巨核祖細胞株M07e細胞為研究對象,利用細胞活性分析和流式細胞術(shù)實驗,分析Klotho對巨核細胞生成血小板整個過程的影響;隨后,觀察Klotho對放射損傷所致血小板減少的防治作用及機制;最后,復(fù)制小鼠5/6腎大部切除CKD模型,采用Western blot、流式細胞術(shù)、細胞免疫熒光、激光共聚焦及體內(nèi)/外血栓形成實驗,觀察Klotho對CKD情況下血小板異常活化的抑制作用及相關(guān)機制。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:1.體外研究證實,正常情況下Klotho對巨核祖細胞的增殖、巨核細胞的分化成熟及血小板的產(chǎn)生和釋放沒有顯著的影響作用。2.亞致死劑量的電離輻射可以導(dǎo)致巨核祖細胞ROS過度生成、大量凋亡及血小板水平嚴(yán)重降低。輻照前給予Klotho預(yù)處理可以抑制電離輻射誘導(dǎo)的巨核祖細胞ROS生成及凋亡,并加速小鼠電離輻射后血小板水平的恢復(fù),提示Klotho對電離輻射后血小板減少癥有一定的預(yù)防和救治作用。3.在CKD小鼠模型中,隨著尿毒癥毒素硫酸吲哚酚(Indoxyl sulphate,IS)在體內(nèi)的蓄積,Klotho水平顯著下降,而血小板的活性則表現(xiàn)出異常增高。4.IS在體內(nèi)和體外均可誘導(dǎo)血小板高度活化,Klotho則能顯著抑制IS誘導(dǎo)的血小板活化;CKD小鼠體內(nèi)Klotho水平的降低會進一步加重IS誘導(dǎo)的血小板異常活化及血栓形成。5.體外研究結(jié)果表明,IS通過誘導(dǎo)血小板內(nèi)ROS大量生成并激活其下游p38MAPK信號通路來促進血小板活化及血栓形成;而Klotho可以顯著抑制IS誘導(dǎo)的血小板內(nèi)ROS過度生成及p38MAPK激活,提示Klotho抑制IS誘導(dǎo)的血小板異常活化和血栓形成與其所具有的突出抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。6.采用apoE-/-小鼠建立高脂血癥及CKD合并高脂血癥動物模型發(fā)現(xiàn),IS及CKD誘導(dǎo)的血小板過度活化可以加速動脈粥樣硬化進展,而外源性Klotho處理可以抑制IS及CKD誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化形成加速�？傊�,通過本實驗研究,我們首次明確了Klotho作為一種內(nèi)源性抗氧化蛋白,一方面可以預(yù)防電離輻射誘導(dǎo)的巨核祖細胞凋亡及血小板水平降低,另一方面還可以抑制IS誘導(dǎo)的血小板過度活化,從而防止血栓及動脈粥樣硬化形成,為臨床血小板減少癥及血栓相關(guān)疾病的預(yù)防和救治提供新思路、新方法。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R818

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