本文關(guān)鍵詞：基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的中藥三種單體成分體外代謝研究

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【摘要】：藥物在體內(nèi)經(jīng)吸收、分布之后,可經(jīng)藥物代謝酶催化生成代謝產(chǎn)物,產(chǎn)生藥理或毒理作用,研究藥物代謝對明確其代謝途徑和代謝機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義。肝臟是參與藥物代謝的重要器官,富含藥物代謝酶,是藥物發(fā)生I相和II相代謝反應(yīng)的主要場所。肝微粒體是肝內(nèi)代謝酶的主要來源,包含催化I相代謝的CYP450酶和II相代謝的UGTs等酶類。其代謝模型操作簡單、價格合理、儲存方便,現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于體外藥物代謝的研究中。近年來,隨著中藥現(xiàn)代化研究及藥物分析技術(shù)的發(fā)展,對中藥單體成分特別是對中藥有效成分的代謝研究逐漸成為人們關(guān)注的熱點。本研究選取中藥白芷主要成分香豆素類化合物蛇床夫內(nèi)酯及中藥芫花主要成分黃酮類化合物羥基芫花素和芫花素,利用高分辨質(zhì)譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),采用人肝微粒體溫孵、重組酶溫孵及化學(xué)抑制劑試驗等方法,對三個單體成分在人肝微粒體中的代謝進(jìn)行研究并對代謝表型進(jìn)行鑒別,推測可能的代謝途徑并進(jìn)行比較,為進(jìn)一步理解其代謝機(jī)制提供依據(jù)和技術(shù)支持。第一部分蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體中的代謝產(chǎn)物鑒定目的:本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù),建立蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素的人肝微粒體體外溫孵模型,對其在人肝微粒體中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定,并歸納總結(jié)其代謝途徑,為進(jìn)一步闡明其體內(nèi)過程提供理論依據(jù)。方法:通過向含有人肝微粒體的溫孵體系中加入NADPH和UDPGA作為反應(yīng)啟動因子,建立I相代謝、葡萄糖醛酸化代謝及級聯(lián)代謝反應(yīng)的溫孵模型。建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法對蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體溫孵樣品中的各類代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測,將采集到的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)借助Peakview 1.2和Metabolite Pilot 1.5數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析,總結(jié)三個化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律,推測代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)并推斷其代謝途徑。結(jié)果:采用蛇床夫內(nèi)酯對照品對溫孵樣品內(nèi)的原型藥物進(jìn)行確證,正離子模式下,蛇床夫內(nèi)酯主要脫去異戊烯基形成m/z 233的特征碎片離子,而后連續(xù)丟失CO,符合香豆素類化合物的一般裂解規(guī)律。通過與空白組和對照組溫孵樣品比較,在溫孵樣品中共鑒定出24個蛇床夫內(nèi)酯的I相代謝產(chǎn)物,分別為蛇床夫內(nèi)酯經(jīng)氧化、與水加成、羧基化和脫氫作用生成。其中加氧后的羥基化代謝物M1、M2和環(huán)氧化代謝物M3為蛇床夫內(nèi)酯在人肝微粒體中最主要的代謝產(chǎn)物。但是未檢測到蛇床夫內(nèi)酯及其I相代謝物的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物,可能與其結(jié)構(gòu)中不含易與葡萄糖醛酸發(fā)生II相結(jié)合反應(yīng)的活潑H有關(guān)。采用羥基芫花素和芫花素對照品對溫孵樣品內(nèi)的原型藥物進(jìn)行確證,負(fù)離子模式下,羥基芫花素和芫花素主要發(fā)生黃酮類化合物特征性的RDA裂解。通過與空白組和對照組溫孵樣品比較,在羥基芫花素溫孵樣品中共發(fā)現(xiàn)10個代謝產(chǎn)物,其中包括3個I相代謝產(chǎn)物、3個葡萄糖醛化產(chǎn)物和4個級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物。在芫花素溫孵樣品中共發(fā)現(xiàn)19個代謝產(chǎn)物,其中包括7個I相代謝物、2個葡萄糖醛酸化代謝物和10個級聯(lián)反應(yīng)代謝物。兩化合物經(jīng)去甲基和氧化引入羥基,而后與葡萄糖醛酸結(jié)合,II相代謝為其主要代謝反應(yīng)類型。結(jié)論:三種單體成分均發(fā)生Ⅰ相代謝反應(yīng),引入羥基等極性基團(tuán),代謝產(chǎn)物極性增大,黃酮類成分羥基芫花素和芫花素更能與葡萄糖醛酸結(jié)合發(fā)生Ⅱ相代謝反應(yīng),葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物極性進(jìn)一步增加,更易于排出體外。第二部分蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素在人源CYP450酶中的代謝表型鑒定目的:本試驗應(yīng)用HPLC-Q-TRAP-MS/MS和UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù),分別采用肝微粒體結(jié)合選擇性化學(xué)抑制劑和c DNA重組酶孵育法,對參與蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體中代謝的CYP450酶表型進(jìn)行鑒定,為闡明其代謝機(jī)制和臨床安全合理用藥提供理論依據(jù)。方法:將蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素與CYP450酶各亞型的選擇性化學(xué)抑制劑在人肝微粒體中共同孵育,對三個單體成分反應(yīng)后的剩余量進(jìn)行測定,然后與不加入化學(xué)抑制劑的陰性對照溶液比較,考察化學(xué)抑制劑對三個單體成分代謝轉(zhuǎn)化率的影響。建立蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素與CYP450各亞型重組酶的溫孵體系,測定CYP450重組酶溫孵樣品中三個單體成分反應(yīng)后的剩余量,與加入滅活肝微粒體的對照組相比,應(yīng)用底物消除法評價CYP450酶對藥物清除的貢獻(xiàn)。結(jié)果:蛇床夫內(nèi)酯化學(xué)抑制劑試驗結(jié)果顯示,其代謝轉(zhuǎn)化率隨著CYP1A2和CYP3A4的選擇性抑制劑α-萘黃酮和酮康唑濃度的增加有較為顯著的下降。與CYP450重組酶的溫孵反應(yīng)中,隨著反應(yīng)時間的增加,重組酶CYP1A2和CYP3A4溫孵體系中蛇床夫內(nèi)酯的消較為明顯,而其他亞型組含量變化較小。CYP1A2和CYP3A4能夠催化蛇床夫內(nèi)酯生成其主要單氧化代謝產(chǎn)物M1、M2和M3。羥基芫花素和芫花素的代謝轉(zhuǎn)化率均隨CYP1A2、CYP2C9和CYP2C19的選擇性抑制劑α-萘黃酮、磺胺苯吡唑和鹽酸噻氯匹定濃度的增加有明顯下降,以CYP2C9最為顯著。與CYP450重組酶的溫孵反應(yīng)中,隨著反應(yīng)時間的增加,重組酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4可催化羥基芫花素和芫花素代謝消除。CYP1A2和CYP3A4可同時催化去甲基和單氧化反應(yīng),CYP1A2的催化活性高于CYP3A4。CYP2C9和CYP2C19主要介導(dǎo)羥基芫花素的去甲基化代謝,以CYP2C9的催化活性最高。結(jié)論:蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素均可經(jīng)CYP1A2和CYP3A4催化生成主要的氧化代謝產(chǎn)物,CYP2C9和CYP2C19在催化羥基芫花素和芫花素去甲基化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,代謝表型的鑒定也為進(jìn)一步研究藥物在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化及預(yù)測藥物相互作用提供了理論依據(jù)。第三部分羥基芫花素和芫花素在人源UGT酶中的代謝表型鑒定目的:應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù),采用人肝微粒體UGT重組酶孵育法,對參與羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體中代謝的UGT酶表型進(jìn)行鑒定,為闡明其代謝機(jī)制和臨床安全合理用藥提供理論依據(jù)。方法:建立羥基芫花素和芫花素與UGT重組酶的溫孵體系,通過UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法測定溫孵樣品中葡萄糖醛酸化代謝物的生成量,并比較葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物在各UGT亞型酶中的生成情況。結(jié)果:試驗結(jié)果表明,UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9、UGT1A10和UGT2B7可參與羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體中的葡萄糖醛酸化代謝;UGT1A1和UGT1A9可介導(dǎo)兩個黃酮類化合物A環(huán)5-羥基和B環(huán)3'-和4'-羥基葡萄糖醛酸化,且催化活性較高;而UGT1A3、UGT1A10和UGT2B7只介導(dǎo)B環(huán)羥基參與反應(yīng),且以UGT1A10催化活性最高。結(jié)論:羥基芫花素和芫花素的葡萄糖醛酸化代謝可經(jīng)UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9、UGT1A10和UGT2B7介導(dǎo),推測UGT1A1、UGT1A9和UGT1A10為參與羥基芫花素和芫花素葡萄糖醛酸化代謝的主要UGT酶。第四部分蛇床夫內(nèi)酯對人肝CYP450酶的抑制作用目的:采用探針底物法,根據(jù)FDA指導(dǎo)原則選擇細(xì)胞色素P450酶亞型特異性探針底物,研究蛇床夫內(nèi)酯對人肝CYP1A、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6和3A4這7種CYP450酶亞型的影響。方法:應(yīng)用體外肝微粒體溫孵體系,建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法,測定各亞型特異性探針底物生成代謝產(chǎn)物的含量,采用Graph Pad Prism 6.0軟件進(jìn)行非線性擬合并計算IC50值,從而評價蛇床夫內(nèi)酯對CYP450酶7個亞型的體外潛在抑制作用。結(jié)果:蛇床夫內(nèi)酯與CYP450酶各亞型探針底物共同孵育結(jié)果顯示,蛇床夫內(nèi)酯可對CYP3A4產(chǎn)生中等強(qiáng)度抑制作用,IC50=6.61μmol·L~(-1);對CYP2C9和CYP2C19產(chǎn)生弱抑制作用,IC50值分別為20.09和17.49μmol·L~(-1);對于CYP1A、2B6、2C8和2D6基本不存在抑制作用,IC50均大于100μmol·L~(-1)。結(jié)論:蛇床夫內(nèi)酯可對CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4產(chǎn)生抑制作用,與經(jīng)這3個CYP450亞型酶代謝的藥物合用時可能因其對酶的抑制作用造成藥物蓄積,使血藥濃度升高,因此需要在聯(lián)合用藥時多加注意。第五部分蛇床夫內(nèi)酯在人肝微粒體中的酶促反應(yīng)動力學(xué)研究目的:研究蛇床夫內(nèi)酯在人肝微粒體中的酶促反應(yīng)動力學(xué),優(yōu)化溫孵試驗反應(yīng)條件,并計算其酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。方法:考察溫孵時間、蛋白濃度和底物濃度對溫孵體系的影響。以磺胺甲VA唑為內(nèi)標(biāo),Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5μm),甲醇和1 mmol·L~(-1)乙酸銨水溶液為流動相,進(jìn)行梯度洗脫,電噴霧離子源(ESI源),正離子模式下MRM監(jiān)測,測定人肝微粒體溫孵樣品中蛇床夫內(nèi)酯的含量。采用Linewrave-Burk作圖法處理數(shù)據(jù),計算酶促動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax。結(jié)果:蛇床夫內(nèi)酯在人肝微粒體體系中最佳溫孵時間為60 min,蛋白濃度為1 mg·m L~(-1),底物濃度為30μmol·L~(-1)。Km=48.75μmol·L~(-1),Vmax=0.5068μmol·(min·mg protein)~(-1)。結(jié)論:該方法簡單、可靠,適用于蛇床夫內(nèi)酯在肝微粒體體系中的測定。蛇床夫內(nèi)酯是一個肝代謝藥物,細(xì)胞色素P450酶作為主要酶系參與其生物轉(zhuǎn)化。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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