本文關鍵詞：人感染圓環(huán)病毒的血清流行病學研究及新型抗圓環(huán)病毒疫苗的研制

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【摘要】：WHO的統(tǒng)計資料表明,近40年來,超過75%的人類新發(fā)傳染病都是由來源于動物的病原體所引起的,這些病原體包括人類免疫缺陷病毒,埃博拉病毒,西尼羅河病毒,尼帕病毒和漢坦病毒等。近年來,人感染H5N1型高致病性禽流感、嚴重急性呼吸窘迫綜合征(SARS)、人感染H7N9禽流感、H1N1甲型流感和埃博拉出血熱等在世界范圍內的暴發(fā)與流行,都嚴重威脅著人類的健康與生命安全,給社會經濟發(fā)展造成了巨大的損失,已經成為影響全球公共衛(wèi)生安全的重大問題。因此,由動物源性的病原體感染所引起的人類疾病受到了越來越多的關注。豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV),是一種在豬群感染率達到52.8%~100%、可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的、已知世界上最小的動物病毒之一。普遍認為PCV僅能感染豬群,但是我們在中國北方成年人群血清中也檢測到了該病毒的抗體,提示這種原本僅在豬群之間傳播的病毒很可能已經跨越種屬間差異,轉化為可以感染人類的病毒,成為一種新的潛在的人獸共患病病原體。應對病毒感染最有效的措施是免疫預防,但由于許多新發(fā)傳染病往往不被人所了解,未能及時研制出疫苗,使得感染不能被有效控制,這使預防工作開展的十分困難。目的:本研究通過流行病學分析,試圖揭示圓環(huán)病毒感染人群的可能相關因素,并以實驗動物小鼠及豬為模型,研制一種有效的預防圓環(huán)病毒感染的疫苗,為今后控制這類病毒感染性疾病的發(fā)生發(fā)展及采取及時有效的預防措施提供依據(jù)。方法:本研究在吉林省范圍內共收集了16831例血清樣本,隨機抽取1267例血清樣本用間接ELISA法檢測血清中PCV Ig G特異性抗體,估計人群中PCV的感染率;采用logistic回歸模型分析PCV感染及其與可能相關因素之間的關聯(lián)性,初步分析PCV感染的可能因素。利用基因克隆技術,以目前流行基因型PCV2b衣殼蛋白作為疫苗的抗原,考慮到PCV2b衣殼蛋白上的誘餌表位對機體防御病毒的不利影響,我們用PCV2b衣殼蛋白上的中和表位替換誘餌表位,觀察誘餌表位對衣殼蛋白結構、刺激中和病毒抗體產生方面的影響,利用PCV2b衣殼蛋白能自組裝成病毒樣顆粒(VLP)的特點,研制開發(fā)一種新型重組亞單位疫苗,探討其在抗病毒感染方面的作用。結果:1.在我國北方地區(qū)吉林省范圍內檢測的1267例成年人血清樣本中,共檢出PCV特異性抗體陽性者63例,PCV抗體陽性檢出率(粗率)為6.39%,提示在成年人群中存在著圓環(huán)病毒的隱性感染,這種隱性感染可能與高血壓或肝硬化相關;農村人口PCV抗體陽性率明顯高于城市人口(P0.001)。2.現(xiàn)有疫苗的應用在預防圓環(huán)病毒相關疾病方面起到了一定的效果,然而PCV2的感染、傳播和流行仍不能被有效控制。這種現(xiàn)狀促使人們研究現(xiàn)有疫苗在刺激機體產生病毒中和抗體的同時,是否還會刺激機體產生有利于病毒感染的免疫應答。本研究發(fā)現(xiàn),滅活病毒疫苗免疫,或是病毒衣殼蛋白亞單位疫苗在制備過程中,亦或天然病毒感染,誘餌表位均有機會暴露在外,刺激機體產生大量的非保護性抗體,干擾機體中和抗體的產生,這些非保護性抗體被證實與圓環(huán)病毒相關疾病有著密切的關系。為了避免PCV2衣殼蛋白上誘餌表位暴露對機體抗病毒免疫的干擾作用,我們用PCV2b衣殼蛋白上的一個中和表位替換誘餌表位,并在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了可溶性表達。經過純化、鑒定后在體外將其組裝成病毒樣顆粒,分別與ISA 206水包油包水型佐劑和ISA 35水包油型佐劑乳化制備成疫苗,并對其物理性狀包括外觀、黏度、穩(wěn)定性等指標進行了評估;通過無菌檢驗和安全性檢驗確定了疫苗的安全性;通過從乳化的疫苗中提取抗原,檢測疫苗在長期保存后抗原的穩(wěn)定性及活性,檢測結果符合疫苗質量標準。隨后將制備的疫苗分別免疫小鼠和仔豬,用血清抗體測定法和免疫仔豬攻毒法評價疫苗的免疫效力,實驗結果表明,該疫苗能夠誘導小鼠產生特異性的抗病毒抗體,其多克隆抗體效價可達1:64000,且能夠為機體提供持續(xù)并且有效的保護作用。免疫仔豬6/6出現(xiàn)了血清抗體陽轉,仔豬抗體滴度可達1:800。免疫仔豬攻毒后組織病毒分離結果表明,免疫仔豬肺組織上清病毒DNA PCR檢測結果為3/6陰性,攻毒對照組所有豬肺組織上清PCR檢測均為陽性,免疫仔豬腹股溝淋巴結組織的病毒DNA載量要明顯低于攻毒對照組。通過對豬組織病理病變程度進行打分,也可以發(fā)現(xiàn)免疫組的組織病變及損傷程度要明顯輕于攻毒對照組。結論:1.在中國北方成年人群血清中檢測到圓環(huán)病毒抗體,提示在成年人群中存在著圓環(huán)病毒的隱性感染,這種隱性感染可能與高血壓或肝硬化相關。2.利用基因克隆技術,用中和表位替換PCV2b衣殼蛋白上的誘餌表位,構建、表達并純化了一種新型抗PCV2重組亞單位疫苗抗原。3.制備的替換掉誘餌表位的重組PCV2b衣殼蛋白亞單位疫苗能夠誘導小鼠和仔豬產生抗病毒特異性抗體,能夠有效地抑制病毒在仔豬體內的復制,具有良好的免疫原性,具備開發(fā)成為一種新型抗圓環(huán)病毒疫苗的潛能。為今后研制相關疫苗從而更有效地預防病毒感染及流行提供了可參考的實驗基礎及技術平臺。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R511

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