本文關鍵詞：CaMKKβ抑制劑STO-609誘導胃腺癌細胞凋亡的機制研究

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【摘要】：研究背景:胃癌是在世界范圍內常見的惡性腫瘤,具有非常高的腫瘤相關的死亡率。胃癌的預后較差,在疾病的早期階段,病人的臨床癥狀不特異的癥狀,因此我國大部分的胃癌于臨床診斷時已處于進展期,整體的預后及生存率遠不如早期病例占多數的日本、韓國。在我國胃癌已經成為重要的衛(wèi)生負擔,雖然臨床及基礎的研究取得了長足的進步,但總體而言我國胃癌治療的效果仍不滿意。故此,對胃癌的早期診斷及與腫瘤的演進相關的信號通路及激酶等的研究,一直是胃癌基礎研究的一個重要的方向。Ca MKKβ是鈣調蛋白激酶家族成員,最初的研究多集中在其作為全身及具體的器官能量平衡的調控因子的作用,在諸如自身免疫性疾病、慢性炎癥、神經系統(tǒng)退行性變、炎癥等系統(tǒng)性疾病等方面;而最近的研究提示包含消化系統(tǒng)腫瘤在內的多種腫瘤,存在了Ca MKKβ的異常,但關于Ca MKKβ與胃癌的研究較少。目前已知的Ca MKKβ的下游激酶主要有AMPK、Ca MK及Akt,但在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中Ca MKKβ究竟扮演著何種的角色,是學者們關心但尚未明確的問題。STO-609是Ca MKKβ的選擇性抑制劑,研究已經發(fā)現在多種腫瘤,STO-609可以抑制腫瘤細胞的活力等。但STO-609抑制腫瘤的具體機制不詳,只有零星的報道探討了STO-609與Ca MKKβ的下游分子靶標的作用關系,而STO-609能否成為胃癌治療潛在的藥物的前提,則是對其作用機制及耐藥機制的探討。目的:1.探討Ca MKKβ在胃癌組織及非癌組織中的表達是否存在差異,如果存在差異,則進一步探討胃癌組織的Ca MKKβ的表達與臨床病理學特征及預后的相關性。2.探討Ca MKKβ的特異性抑制劑STO-609對胃腺癌細胞活力、凋亡及侵襲能力的影響,探討STO-609對Ca MKKβ的相關下游通路活化的影響。3.利用sh RNA抑制Ca MKKβ和AMPK,探討STO-609誘導胃腺癌細胞凋亡的作用及與Ca MKKβ下游信號通路的關系。方法:1應用免疫組織化學的方法檢測胃癌組織與癌旁組織及正常組織的Ca MKKβ的表達。2應用統(tǒng)計學軟件綜合分析胃癌的Ca MKKβ表達與胃癌的組織分型、腫瘤直徑、Lauren分型及淋巴結轉移等臨床病理學特征及預后進行分析。3通過臺盼蘭染色探討STO-609的對胃腺癌細胞存活率的影響。4通過Western Blot檢測STO-609對胃腺癌細胞Ca MKKβ下游AMPK、Akt、ERK的表達水平。5通過凋亡-壞死定量檢測試劑盒及Western Blot檢測STO-609的對胃腺癌細胞凋亡率的影響。6通過Trans-well侵襲室檢測STO-609的對胃腺癌細胞侵襲能力的影響。7通過sh RNA抑制Ca MKKβ和AMPK,檢測STO-609對胃腺癌細胞活力、凋亡及侵襲能力的影響,及AMPK、Akt、ERK的表達水平變化。8通過IBM SPSS 24.0對數據進行統(tǒng)計學分析。結果:1.93例胃癌組織中61例Ca MKKβ表達陽性為,21例癌旁組織中10例表達陽性,17例正常組織中6例表達陽性,陽性率分別為81.7%、46.6%、54.5%,差異具有統(tǒng)計學意義;2.在胃腺癌組織的Ca MKKβ表達評分上,T2期及以下腫瘤組織的評分為1.03±0.79,T2期以上腫瘤組織的評分為1.93±1.05,差異有統(tǒng)計學意義。多因素分析顯示Ca MKKβ的強陽性表達是預后的獨立危險因素,與弱陽性組相比強陽性組在總生存率上的差異有統(tǒng)計學意義;3.STO-609可以抑制胃腺癌SUN-1細胞及N87細胞的活力。4.STO-609對胃腺癌SUN-1細胞及N87細胞的AMPK、Akt、ERK的活化有抑制作用。5.STO-609對胃腺癌SUN-1細胞及N87細胞的凋亡有誘導作用。6.STO-609對胃腺癌SUN-1細胞及N87細胞的侵襲能力有抑制作用。7.與對照組相比,Ca MKKβsh RNA對STO-609引起的胃腺癌SUN-1細胞的凋亡存在抑制作用,但AMPK sh RNA無明顯抑制凋亡的作用。8.與對照組相比,AMPK sh RNA對STO-609引起的胃腺癌SUN-1細胞的活力抑制及凋亡誘導無抑制作用;AMPK sh RNA對STO-609引起的SUN-1細胞的Akt及ERK活化無抑制作用。結論:1.胃癌組織的Ca MKKβ的表達明顯高于癌旁組織及正常組織,Ca MKKβ的表達與腫瘤的浸潤深度相關且強陽性表達提示預后不良,可能成為潛在的分子標志物;2.STO-609抑制胃腺癌細胞活力的作用,可能是與其誘導細胞凋亡有關;STO-609誘導胃腺癌細胞凋亡的作用,與其對Ca MKKβ的下游信號AMPK、Akt、ERK的激活抑制有關。STO-609抑制對胃腺癌細胞的侵襲能力有抑制作用,提示Ca MKKβ抑制劑STO-609可能作為一種新型的抗癌藥物。3.我們進一步研究發(fā)現,AMPK特異性沉默,并沒有影響Ca MKKβ抑制劑STO-609誘導胃癌細胞凋亡作用,提示誘導凋亡的作用可能與Ca MKKβ下游的信號其一的AMPK途徑的機制無關。4.最后,結合我們的整體實驗結果,我們推測:STO-609誘導胃癌細胞凋亡的機制,可能與抑制Ca MKKβ下游信號Akt、ERK及信號途徑之間的交互調控有關。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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