本文關(guān)鍵詞：脯氨酰羥化酶3對糖尿病性心肌病的影響及機制研究

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【摘要】：研究背景糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是發(fā)生于糖尿病(diabetes mellitus, DM)人群中,獨立于冠心病,高血壓和心臟瓣膜病之外的心臟疾病。糖尿病性心肌病是糖尿病最主要的致死原因之一。糖尿病性心肌病早期表現(xiàn)為心肌細胞肥大和舒張功能不全,晚期主要表現(xiàn)為收縮功能不全,易并發(fā)充血性心力衰竭,甚至猝死。心肌細胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化是糖尿病性心肌病的主要病理特征,也是導(dǎo)致糖尿病性心肌病心功能損害的重要病理因素。脯氨酰羥化酶3(prolyl hydroxylase 3, PHD3)是脯氨酰羥化酶家族成員之一。PHD3在缺氧時表達增加,并使缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)發(fā)生羥基化而降解,維持體內(nèi)HIF-1α的動態(tài)平衡。除缺氧外,許多其他細胞內(nèi)因子也能調(diào)節(jié)PHD3的表達,如在人內(nèi)皮細胞中,干擾素γ刺激PHD3表達增加；在核髓質(zhì)細胞中,腫瘤壞死因子α和白介素1β上調(diào)PHD3的表達。除了作為一種氧傳感器發(fā)揮作用外,PHD3還可不依賴于HIF-1α,在細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、組織纖維化等方面也發(fā)揮重要作用。PHD3主要定位于心肌細胞,在多種心血管疾病如心肌梗死、心肌缺血/再灌注損傷、充血性心力衰竭等心肌組織內(nèi)均可檢測到PHD3蛋白表達上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病合并心肌梗死大鼠模型中,辛伐他丁可通過抑制PHD3發(fā)揮心肌保護作用。然而,PHD3在糖尿病性心肌病中具體的作用及機制尚未有人研究。本實驗利用高脂喂養(yǎng)和鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射誘導(dǎo)大鼠糖尿病性心肌病模型,探討PHD3在糖尿病性心肌病中的作用及其機制。研究目的1.研究心肌組織中PHD3對糖尿病性心肌病大鼠心臟重構(gòu)和心功能損傷的影響。2.研究心肌組織中PHD3對糖尿病性心肌病大鼠心肌細胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化的影響。研究方法1.大鼠糖尿病性心肌病模型的建立60只雄性Sprague-Dawley大鼠(100-120 g)隨機分為四組(每組n=15)：control組；糖尿病組(DM組)；糖尿病+PHD3-shRNA'慢病毒轉(zhuǎn)染組(DM+shPHD3 組);糖尿病+慢病毒空載體轉(zhuǎn)染組(DM+shN.C組)。Control組給予正常飲食,其余3組給予高脂飲食。4周后,所有大鼠行腹腔葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)和腹腔胰島素耐量試驗(intraperitoneal insulin tolerance test, IPITT)成功誘導(dǎo)胰島素抵抗的大鼠腹腔注射35mg/kg的鏈脲菌素(streptozotocin, STZ)。STZ注射1周后檢測空腹血糖,隨機兩次空腹血糖≥11.1mmol/L認為2型糖尿病造模成功。成功誘導(dǎo)2型糖尿病的大鼠繼續(xù)給予高脂飲食喂養(yǎng),至STZ注射后第8周行大鼠心功能檢測,若出現(xiàn)左室舒張功能障礙則提示糖尿病大鼠開始向糖尿病性心肌病進展,此時可對其進行PHD3慢病毒及空載體慢病毒體內(nèi)干預(yù)。2.PHD3-shRNA'慢病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染設(shè)計3對針對大鼠PHD3基因的shRNA質(zhì)粒,篩選后選擇沉默效率最高的序列構(gòu)建含有綠色熒光蛋白(GFP)報告基因的慢病毒載體。PHD3的干擾序列為5′-GGGCAAATACTATGTCAAG-3',空載體序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。STZ注射8周后,頸靜脈注射PHD3-shRNA'漫病毒和空載體慢病毒,4周后取材,制備冰凍切片檢測病毒轉(zhuǎn)染效率。3.超聲心動圖檢測大鼠左室功能采用二維、M超、脈沖和組織多普勒技術(shù)評價大鼠左室功能。4.組織學染色心臟取材后稱重,測量心臟大小,留取心臟大體照片。甲醛固定后,在左室乳頭肌水平橫切并制備石蠟切片,應(yīng)用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining,HE)染色、Masson染色、天狼猩紅染色檢測心臟的大體形態(tài)結(jié)構(gòu)和心肌膠原含量。應(yīng)用免疫組化染色檢測心肌組織PHD3、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ的分布和表達情況。5. Tunel檢測應(yīng)用Tunel檢測大鼠心肌組織中細胞凋亡的情況。6.明膠酶譜應(yīng)用明膠酶譜法檢測心肌組織MMP-2和MMP-9的活性。7.蛋白印跡分析提取大鼠心肌組織蛋白,檢測PHD3、cleaved caspase-3、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、 MMP-2、MMP-9的蛋白表達水平。8.統(tǒng)計學分析各組實驗至少獨立重復(fù)三遍。應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析處理數(shù)據(jù),以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示。p0.05認為有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果1.高脂飲食4周成功誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗大鼠正常和高脂飲食4周后行IPGTT和IPITT檢測。結(jié)果顯示,與對照組大鼠相比,高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠在0 min、15min、30min、60min、120 min時血糖值顯著升高,血糖曲線下面積(the area under the curve, AUC)顯著增加。2.PHD3在糖尿病大鼠心肌組織中表達增高與對照組大鼠相比,糖尿病組大鼠心肌組織PHD3的蛋白表達水平顯著增加。與糖尿病組大鼠相比,PHD3-shRNA'慢病毒轉(zhuǎn)染組大鼠PHD3蛋白水平明顯降低,基因干預(yù)可以有效抑制心肌組織PHD3的表達。3.PHD3基因沉默改善糖尿病引起的左室重構(gòu)與正常組大鼠相比,糖尿病大鼠心臟明顯增大,心身比值明顯增加；左室乳頭肌切面HE染色顯示,糖尿病大鼠左室呈向心性肥厚；心肌橫切面HE染色顯示心肌細胞直徑顯著增加。抑制PHD3可明顯改善糖尿病引起的上述心臟結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化。4.PHD3基因沉默改善糖尿病引起的心功能損害與正常組大鼠相比,糖尿病組大鼠心功能損害主要表現(xiàn)為舒張功能異常同時伴有收縮功能下降,表現(xiàn)為E/A、E'/A'、LVEF、FS值降低,LVEDd值增加。PHD3基因沉默顯著改善上述心功能異常。5.抑制PHD3明顯改善糖尿病大鼠的心肌凋亡程度Tunel染色顯示糖尿病大鼠心肌細胞的凋亡程度較正常大鼠明顯增加。Western blot檢測顯示心肌組織cleaved caspase-3的表達水平顯著增高。抑制PHD3明顯降低糖尿病大鼠心肌細胞的凋亡程度和cleaved capase-3的蛋白表達水平。6.抑制PHD3明顯改善糖尿病大鼠的心肌纖維化程度Masson和天狼猩紅染色顯示,與正常大鼠相比,糖尿病大鼠心肌間質(zhì)膠原沉積明顯增加。免疫組織化學和western blot檢測顯示心肌組織膠原Ⅰ、膠原Ⅲ表達水平顯著增高。抑制PHD3顯著降低心肌間質(zhì)膠原沉積和膠原Ⅰ、膠原Ⅲ的表達水平。7.抑制PHD3減少心肌組織MMP2、MMP-9的表達與正常大鼠相比,糖尿病大鼠心肌細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達水平明顯增高。抑制PHD3后MMP-2、MMP-9蛋白表達水平降低。明膠酶譜檢測顯示糖尿病大鼠心肌細胞MMP-2活性增加,抑制PHD3后活性降低。研究結(jié)論1.PHD3在糖尿病大鼠心肌組織中表達增加；2.應(yīng)用PHD3-shRNA慢病毒體內(nèi)干預(yù)后,心肌組織PHD3的蛋白表達水平被有效抑制；3.抑制心肌組織PHD3的表達可改善糖尿病大鼠的心臟重構(gòu)和心功能損害；4.抑制PHD3后糖尿病大鼠心功能損害的減輕主要與其降低心肌凋亡和纖維化有關(guān)。研究背景近年來,糖尿病(diabetes mellitus, DM)患病率急劇上升,嚴重威脅人類健康。持續(xù)的高糖血癥可導(dǎo)致腎臟、心臟、眼、神經(jīng)等多種器官功能的損害,其中心血管并發(fā)癥是糖尿病患者最主要的死亡原因之一。糖尿病患者出現(xiàn)心臟重構(gòu)和心功能損害,排除冠心病、高血壓、心臟瓣膜病等其他可以影響心肌的疾病,稱為糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)。心肌細胞凋亡是糖尿病性心肌病心臟重構(gòu)和心功能損害的重要病理生理機制。動物模型研究發(fā)現(xiàn),心肌細胞凋亡貫穿于整個糖尿病性心肌病病程中,并有逐漸加重的趨勢。心肌細胞數(shù)量丟失可誘導(dǎo)心肌細胞代償性肥大,表現(xiàn)為心肌肥厚,出現(xiàn)舒張功能障礙。隨著心肌凋亡程度的加重,心肌組織逐漸轉(zhuǎn)為失代償狀態(tài),表現(xiàn)為心臟收縮功能受損,易并發(fā)心力衰竭、心律失常甚至猝死。高糖血癥可損傷細胞線粒體,使細胞色素C和活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成增多,通過細胞內(nèi)線粒體途徑誘導(dǎo)心肌細胞凋亡。然而,糖尿病誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的機制尚未完全明確。脯氨酰羥化酶3(prolyl hydroxylase 3, PHD3)是脯氨酰羥化酶(PHD)家族成員之一。在缺氧狀態(tài)下反應(yīng)性增加,調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1α (hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)的表達。然而缺氧并不是刺激PHD3表達增加的唯一因素,研究發(fā)現(xiàn),在常氧狀態(tài)下,多種細胞因子如干擾素γ (interferon-gamma, IFNγ)、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNFα)、白介素1β (interleukin 1β, IL-1β)也可上調(diào)PHD3的蛋白表達水平。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),糖尿病心肌組織PHD3的蛋白表達水平顯著增加,但糖尿病誘導(dǎo)PHD3高表達的機制尚不清楚。在心肌細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞等多種細胞中,高糖刺激均可使細胞ROS生成增多,并參與高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡過程。研究發(fā)現(xiàn),在缺氧條件下,ROS可與脯氨酰羥化酶相互作用,調(diào)節(jié)脯氨酰羥化酶的活性。ROS調(diào)節(jié)PHD3活性的作用具有濃度依賴性,低水平的ROS使PHD的活性增強,高水平的ROS則抑制PHD的活性。在高糖狀態(tài)下ROS是否介導(dǎo)了PHD3的表達尚未有人研究。我們的前期研究表明,PHD3在糖尿病性心肌病中能促進心肌細胞凋亡,但其具體分子機制尚未探討。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路可在高糖和糖尿病狀態(tài)下激活,并促進細胞凋亡、纖維化、炎癥等多種反應(yīng)。在糖尿病性心肌病中,PHD3的促凋亡作用是否與MAPK相關(guān)尚待研討。綜上所述,本實驗應(yīng)用高糖刺激H9c2心肌細胞和原代心肌細胞模擬糖尿病狀態(tài)下體內(nèi)的高糖血癥內(nèi)環(huán)境,探討高糖誘導(dǎo)心肌細胞PHD3表達上調(diào)的機制及PHD3在高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡中的作用及機制。研究目的1.研究高糖誘導(dǎo)心肌細胞PHD3表達增加的機制。2.研究PHD3對高糖誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的影響。3.探討PHD3介導(dǎo)高糖環(huán)境下心肌細胞凋亡的信號分子機制。研究方法1.細胞的獲取(1)大鼠H9c2心肌細胞系：購自美國American Type Cell Collection公司。(2)原代心肌細胞：由2-3天的大乳鼠左室組織提取。2.細胞培養(yǎng)本實驗應(yīng)用高糖(33.3mM)培養(yǎng)基刺激心肌細胞6 h、12 h、 24 h、48 h,使用正常糖濃度(5.5 mM)的培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細胞作為對照。3.PHD3表達的干預(yù)設(shè)計3對針對PHD3基因的siRNA表達載體,經(jīng)篩選后選擇沉默效率最高的PHD3-siRNA抑制H9c2心肌細胞PHD3的基因表達。4.激光共聚焦顯微鏡應(yīng)用免疫熒光染色法檢測H9c2心肌細胞內(nèi)PHD3的含量和分布。5.ROS的檢測使用DCFH-DA探針檢測高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細胞生成ROS的熒光強度,以及應(yīng)用細胞ROS清除劑NAC后ROS的熒光強度。6. Tunel檢測凋亡檢測各組H9c2心肌細胞的細胞凋亡程度,計算細胞凋亡率。7.蛋白印跡提取各組細胞蛋白,檢測PHD3、cleaved caspase-3、HIF-1α、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38的蛋白水平。8.統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析處理數(shù)據(jù),并以均數(shù)±標準差表示,p0.05認為有統(tǒng)計學差異。研究結(jié)果1.在H9c2心肌細胞系和原代心肌細胞中,高糖均誘導(dǎo)PHD3表達增加。應(yīng)用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細胞和原代心肌細胞6h,12 h,24 h,48 h, PHD3的蛋白表達水平逐漸增加,具有時間依賴性。免疫熒光檢測顯示,PHD3大量定位于胞漿,少量定位于胞核。2.ROS介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的PHD3表達上調(diào)。高糖刺激H9c2細胞6 h,12 h,24 h,48 h, ROS的生成增加,具有時間依賴性。應(yīng)用細胞ROS清除劑NAC后,ROS的表達明顯減少,同時PHD3的蛋白表達水平顯著降低。3.抑制PHD3減少高糖引起的心肌細胞凋亡。應(yīng)用PHD3-siRNA轉(zhuǎn)染H9c2細胞抑制PHD3表達,檢測PHD3對細胞凋亡的影響。Western blot及Tunel檢測結(jié)果顯示,高糖能增加H9c2細胞凋亡,而抑制PHD3可降低高糖誘導(dǎo)增加的cleaved caspase-3水平及細胞凋亡率。4.在高糖環(huán)境下,PHD3的作用與HIF-1α無關(guān)應(yīng)用高糖刺激原代心肌細胞6h,12 h,24 h,48 h, HIF-la的表達水平無明顯變化,應(yīng)用PHD3 siRNA抑制H9c2細胞PHD3的表達后,HIF-1α的表達仍未有改變。5.抑制PHD3降低高糖誘導(dǎo)的心肌細胞MAPK磷酸化水平。Western blot檢測H9c2細胞中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38及p38水平,結(jié)果顯示抑制PHD3能夠顯著降低高糖誘導(dǎo)的ERK及JNK的磷酸化水平的上調(diào),而對p38的磷酸化水平無影響。研究結(jié)論1.ROS介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的心肌細胞PHD3表達上調(diào)。2.抑制PHD3減少高糖引起的心肌細胞凋亡。3.抑制PHD3減少心肌細胞凋亡的作用是通過阻斷MAPKs信號通路實現(xiàn)的。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R542.2

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