本文關(guān)鍵詞：法舒地爾對小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)是各種致病因素導(dǎo)致的肺組織液體生成增多或重吸收障礙以及肺組織大量炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥介質(zhì)釋放,使氣血交換不足,氧合下降,最終出現(xiàn)的呼吸衰竭綜合征。ALI/ARDS致病因素復(fù)雜,包括各種肺內(nèi)外致病因素,如重癥肺炎、胃內(nèi)容物誤吸、敗血癥、重度燒傷和創(chuàng)傷等。在美國,每年約有200,000重癥ARDS患者,其死亡率為40%。ARDS發(fā)病率逐年升高,病情兇險(xiǎn),嚴(yán)重威脅患者生命健康狀況。近30年來,盡管大量基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)顯示某些藥物或干細(xì)胞治療可改善ALI/ARDS患者或動物模型肺損傷指標(biāo),但是,目前臨床上除機(jī)械通氣等對癥支持治療和加強(qiáng)護(hù)理外,美國食品與藥品監(jiān)督局(Food and Drug Administration,FDA)暫未批準(zhǔn)治療ARDS的有效藥物。因此,探索與ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子靶點(diǎn),發(fā)現(xiàn)可能預(yù)防和治療ALI/ARDS的藥物具有重要意義。Rho激酶(Rho Kinase,ROCK)是一種小分子GTP結(jié)合蛋白Rho的效應(yīng)器。研究表明,Rho/ROCK信號在各種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用,例如平滑肌細(xì)胞收縮、肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞運(yùn)動、炎癥細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂和基因表達(dá)等。ROCK信號參與多種疾病的發(fā)生,例如中風(fēng)、血管痙攣、動脈硬化、高血壓、心力衰竭和缺血再灌注損傷等。研究表明,在呼吸系統(tǒng)疾病中,ROCK抑制劑能有效緩解肺動脈高壓、支氣管哮喘、肺纖維化等疾病;此外,動物實(shí)驗(yàn)研究顯示抑制ROCK活性可減輕氣道炎癥,改善肺損傷,但ROCK抑制劑預(yù)防肺損傷的機(jī)制尚不明確。由于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞是呼吸膜的組成成分之一,在肺損傷所致的肺水腫和肺部炎癥中發(fā)揮重要作用,而ROCK在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)含量較高,且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。因此,本文第一部分工作通過構(gòu)建小鼠ALI模型,觀察ROCK抑制劑法舒地爾對LPS誘導(dǎo)的肺組織病理損傷、肺部炎癥、肺組織通透性以及肺內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是否有保護(hù)作用;第二部分工作通過建立中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系,運(yùn)用LPS體外誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cell,HPMEC)炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮屏障損傷和細(xì)胞凋亡,深入探討法舒地爾對ALI發(fā)揮保護(hù)作用的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制。第一部分法舒地爾對小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用目的:觀察法舒地爾對ALI小鼠肺組織ROCK活性、病理損傷、中性粒細(xì)胞滲出、炎癥介質(zhì)釋放、肺組織通透性、肺水轉(zhuǎn)運(yùn)以及肺內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。方法:運(yùn)用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,5mg/kg)氣道滴注構(gòu)建小鼠急性肺損傷模型,fasudil組和LPS + fasudil組小鼠在造模前1小時(shí)予以腹腔注射法舒地爾(10mg/kg)。造模24小時(shí)后,處死小鼠,分別收集動物外周血、肺組織、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)標(biāo)本。運(yùn)用蘇木素-伊紅(hematoxylin-and-eosin,HE)染色觀察各組小鼠肺組織病理損傷變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測小鼠肺組織和外周血細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平;免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)觀察肺組織中性粒細(xì)胞浸潤情況;酶標(biāo)儀法測定BALF中髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性和肺組織中伊文斯藍(lán)(evans blue dye,EB)滲出含量;BCA法測定BALF中蛋白濃度;蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blotting)檢測肺組織ROCK活性和水通道蛋白5(aquaporin5,AQP5)的表達(dá)水平;免疫熒光染色雙標(biāo)法觀察肺組織內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:首先,氣道滴注LPS導(dǎo)致的肺組織ROCK活性升高能被法舒地爾抑制;法舒地爾顯著減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織病理損傷、抑制中性粒細(xì)胞浸潤、逆轉(zhuǎn)BALF中MPO活性和中性粒細(xì)胞水平;LPS導(dǎo)致肺組織和外周血細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平升高,該作用能被法舒地爾抑制;其次,法舒地爾顯著抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡灌洗液蛋白和EB滲出,減輕LPS誘導(dǎo)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡.,最后,法舒地爾可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的AQP5下調(diào)。結(jié)論:整體實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,ROCK抑制劑法舒地爾能顯著改善LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI,主要表現(xiàn)為法舒地爾能減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織病理損傷、抑制中性粒細(xì)胞浸潤和炎癥介質(zhì)釋放,降低肺組織通透性,減少肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)肺泡腔液體轉(zhuǎn)運(yùn)。第二部分法舒地爾對急性肺損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究目的:運(yùn)用LPS體外誘導(dǎo)HPMECs炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮屏障損傷和細(xì)胞凋亡,探討法舒地爾對ALI發(fā)揮保護(hù)作用的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制。方法:將HPMECs(4-6代)予以不同處理:Con組,1%ECM孵育;fasudil組,1%ECM+1μg/mlfasudil 孵育;LPS 組,1%ECM+1 μg/ml LPS 孵育;LPS+fasudil 組,1%ECM++1μg/mlLPS+1μg/ml(或 0.04μg/ml,0.2μg/ml,1μg/ml)fasudil孵育,法舒地爾在LPS刺激HPMECs前半小時(shí)加入;運(yùn)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法使 HPMECs 中骨形態(tài)蛋白受 Ⅱ(Bone Morphogenic Protein Receptor Ⅱ,BMPRII)表達(dá)上調(diào)或下調(diào),予以法舒地爾和LPS處理。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)方法及目的,于特定時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞和細(xì)胞上清進(jìn)行相關(guān)檢測。運(yùn)用內(nèi)皮細(xì)胞-中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)的方法檢測HPMECs對中性粒細(xì)胞的趨化和粘附作用;實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)檢測趨化因子 CXCL1,CXCL2 和 CXCL8的表達(dá);ELISA測定細(xì)胞上清中CXCL8的含量。運(yùn)用western blotting檢測細(xì)胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule[ICAM]-1)、BMPRⅡ 的表達(dá),ROCK、NF-κB和MAPK信號活化情況,細(xì)胞間連接蛋白包括血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens[ZO]-1)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。熒光酶標(biāo)儀檢測PMECs對低分子右旋糖酐的通透性;免疫熒光染色觀察NF-κB p65核轉(zhuǎn)位情況以及VE-cadherin、ZO-1在PMECs中的表達(dá)分布;Hoechest 33342染色觀察細(xì)胞凋亡。結(jié)果:首先,法舒地爾濃度依賴性地下調(diào)LPS誘導(dǎo)的趨化因子CXCL1,CXCL2和CXCL8的轉(zhuǎn)錄以及CXCL8的分泌,抑制中性粒細(xì)胞向活化的內(nèi)皮細(xì)胞趨化。其次,法舒地爾通過上調(diào)PMECs中BMPRII水平,抑制ICAM-1的表達(dá),減少中性粒細(xì)胞與活化的HPMECs粘附。LPS導(dǎo)致的HPMECs中ROCK、NF-κBP65和p38MAPK活化能被法舒地爾阻斷。最后,法舒地爾顯著上調(diào)LPS誘導(dǎo)的VE-cadherin,ZO-1表達(dá)下降,降低HPMECs的通透性;此外,法舒地爾抑制LPS誘導(dǎo)的凋亡蛋白pro-caspase3的剪切和HPMECs凋亡。結(jié)論:法舒地爾通過抑制肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI。法舒地爾抑制肺微管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙具體表現(xiàn)為以下三個(gè)方面:第一,法舒地爾下調(diào)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞釋放趨化因子,抑制中性粒細(xì)胞向HPMECs趨化;第二,法舒地爾下調(diào)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá),抑制中性粒細(xì)胞向PMECs粘附。第三,法舒地爾通過上調(diào)HPMECs粘附連接蛋白VE-cadherin和緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá),降低PMECs通透性;此外,法舒地爾抑制LPS誘導(dǎo)的PMECs凋亡。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R563.8

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本文編號：1285739