發(fā)布時間：2017-12-13 14:37

  本文關鍵詞：NCAPH在人結直腸癌中的功能作用及其相關分子生物學機制研究

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【摘要】：[目的]收集昆明地區(qū)87例人結直腸癌病例資料及組織標本,用免疫組化法檢測腫瘤組織及正常組織中非SMC凝集蛋白1復合物亞基H(NCAPH)的表達水平并分析其表達水平與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤分期、腫瘤位置及生存預后的關系,初步探索NCAPH在人結直腸癌中的功能作用。隨后在細胞水平上,運用基因干擾的方法研究NCAPH基因對人結腸癌細胞系HCT-116的增殖、遷移及凋亡的影響;并在細胞水平探索NCAPH基因對人結腸癌細胞系HCT-116中上皮間充質轉化途徑的影響,以探討NCAPH基因在結腸癌生長、增殖及發(fā)病機制中的作用。最后,在動物水平上,建立裸鼠荷人結腸癌皮下移植瘤模型,探索NCAPH基因對人結腸癌Balb/c裸鼠皮下移植瘤生長的影響。[方法]1.收集昆明醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科2011年1月-12月診治的結直腸癌手術患者的腫瘤組織和正常組織標本蠟塊,采用免疫組織化學方法分別檢測87例結直腸癌組織和正常組織中NCAPH的表達水平。運用SPSS20.0統計軟件包進行數據分析。計數資料采用率、構成比描述;計量資料正態(tài)分布用X±S,偏態(tài)分布資料采用M±Q描述:計量資料正態(tài)分布多組間比較采用方差分析(ANOVA),無序分類資料的差異比較采用X2檢驗;二分類等級資料比較采用Mann-Whitney秩和檢驗(U檢驗),多分類等級資料比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(H檢驗),生存分析采用Kaplan-Meier法,患者生存多因素分析用Cox回歸。分析NCAPH的表達量與結直腸癌患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤分期、腫瘤位置及生存預后的關系。2.首先用invitrogen公司的在線設計軟件設計3條NCAPH-siRNA,細胞轉染后用實時熒光定量PCR和Western Blot技術驗證每條NCAPH-siRNA的干擾效率,并選出效果最好的一條進行后續(xù)試驗。隨后實驗分為3組:對照組(正常細胞)、陰性對照組(轉染試劑處理)、NCAPH干擾組(NCAPH-siRNA處理)。采用CCK-8方法檢測各處理結腸癌細胞的增殖情況;用Transwell小室和細胞劃痕實驗檢測結腸癌細胞的遷移情況;并用流式、qPCR和Western Blot方法檢測結腸癌細胞凋亡的情況。3.為了探索NCAPH促進結腸癌細胞增殖的機制,我們選擇上皮間充質轉化(EMT)途徑相關蛋白進行進一步研究。采用qPCR和Western Blot技術分析上皮標志基因E-cadherin和β-catenin,以及間充質標記基因Fibronectin和Vimentin的表達情況;并用免疫熒光技術檢測E-cadherin和Fibronectin蛋白在細胞中的表達水平,以研究NCAPH對結腸癌細胞中上皮間充質轉化的影響。4.將不同處理的HCT-116細胞,分別在裸鼠腋下皮下注射約108個細胞,培養(yǎng)21天,建立人結腸癌裸鼠皮下移植瘤模型。分別在1、5、10、14和21天觀察并測量每組裸鼠瘤塊體積的大小,并在21天時取出腫瘤稱重并拍照,用HE染色檢測腫瘤組織的病理特征,用免疫組化技術檢測腫瘤組織中NCAPH蛋白的表達情況。[結果]1.免疫組化結果顯示,NCAPH蛋白在本組人結直腸癌腫瘤組織中的表達具有特異性(P=0.006)。NCAPH表達(+++)的患者年齡較大(P0.05)且在低分化腺癌中出現比率較高(P=0.027);在右半結腸尤其是升結腸組織中有高表達趨勢,但因右半結腸病例數較少,未體現出統計學差異,需進一步擴大樣本量驗證其特異性(P=0.067);NACPH低表達(-,+)患者的生存期要高于高表達的患者(++,+++)(P=0.001);Cox回歸顯示,本組患者的腫瘤位置(左半結腸、右半結腸)(P=0.009),腫瘤分期(P=0.013)及NCAPH表達強度(P=0.005)是其生存的主要影響因素。2.干擾驗證結果顯示,NCAPH siRNA-2可以顯著地抑制NCAPH在HCT-116細胞中的表達,后續(xù)實驗選用NCAPH siRNA-2來進行實驗。CCK-8實驗結果顯示,與正常對照組相比,NCAPH-siRNA明顯降低了 HCT-116細胞的細胞活力(P0.001),陰性對照組與正常對照組相比,沒有顯著差異(P0.05)。細胞遷移劃痕實驗顯示,與正常對照組相比,NCAPH-siRNA明顯抑制了 HCT-116細胞的遷移(P0.001),陰性對照組與正常對照組相比,沒有顯著差異(P0.05)。細胞凋亡檢測結果顯示,與正常對照組相比,NCAPH-siRNA明顯誘導了HCT-116細胞發(fā)生了凋亡(P0.001);陰性對照組與正常對照組相比,沒有顯著差異(P0.05):NCAPH-siRNA明顯促進了促凋亡蛋白Bax的表達(P0.001),而抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(P=0.0119,P0.05)。3.實時熒光定量PCR和Western Blot結果顯示,NCAPH干擾后,上皮標記基因E-cadherin和β-catenin的表達量被明顯增加,而間充質標記基因Fibronectin和Vimentin的表達量被明顯減弱。E-cadherin和Fibronectin蛋白在各組中免疫熒光的結果與前面實時熒光定量PCR和Western Blot結的結果一致。正常對照組和陰性對照組之間,沒有明顯變化。4.在裸鼠成瘤試驗中,正常對照組和陰性對照組的腫瘤生長迅速,21天時腫瘤直徑達15mm左右,重量在180mg左右,而NCAPH干擾組的腫瘤生長明顯減慢,重量明顯減輕。HE結果顯示,NCAPH干擾組的腫瘤組織中細胞增殖被顯著抑制。免疫組化的結果顯示,在正常對照組和陰性對照組中,NCAPH蛋白染色強度比NCAPH干擾組中的強,這說明抑制NCAPH表達可以減慢結腸癌細胞的生長。[結論]1.在本組患者中,相較正常組織,NCAPH在結直腸癌組織中的表達具有特異性;而且相較左半結腸其在右半結腸組織尤其是升結腸中有高表達趨勢,但需進一步擴大樣本量驗證其特異性·,通過生存分析,NACPH表達與患者預后呈負相關,這可能與NCAPH在高齡患者及低分化腺癌患者中高表達(+++)的比率較高有關;Cox回歸顯示,腫瘤位置,腫瘤分期及NCAPH表達強度是本組患者生存的主要影響因素;2.運用RNA干擾技術,獲得NCAPH高效率干擾片段。并通過研究發(fā)現NCAPH基因干擾后,結腸癌細胞系HCT-116的增殖和遷移能力被顯著抑制,并誘導了結腸癌細胞發(fā)生凋亡。這說明NCAPH能夠促進結腸癌細胞系HCT-116的增殖和遷移能力,并抑制結腸細胞凋亡;3.對上皮間充質轉化相關蛋白的研究結果發(fā)現,NCAPH基因干擾后,顯著增加了上皮標記基因(E-cadherin和β-catenin)的表達,明顯減少了間充質細胞標記基因(Fibronectin和Vimentin)的表達,這說明EMT過程被明顯抑制。這表明了,NCAPH可能通過促進結腸癌發(fā)生上皮間充質轉化來發(fā)揮促進結腸癌生長增殖的作用。但需進行進一步的信號通路檢測試驗來進行驗證,同時進行動物水平功能驗證。4.裸鼠成瘤實驗結果表明,NCAPH表達抑制的結腸癌細胞裸鼠成瘤速度和瘤體大小明顯被減弱,大大地抑制結腸癌細胞的增殖,抑制了腫瘤生長。這結果都說明了 NCAPH基因可以促進結腸癌細胞的生長和增殖,NCAPH基因與結腸癌的發(fā)生和生長有著密切的關系。
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

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本文編號：1285535