本文關(guān)鍵詞：基于APP阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因模型的腦微血管和神經(jīng)元病變相關(guān)性研究

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【摘要】：研究目的:β-淀粉樣蛋白(amyloid proteinβ,Aβ)假說(shuō)在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)發(fā)病機(jī)制假說(shuō)中占非常重要的地位。基于Aβ假說(shuō)我們建立了AD轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú),發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)腦微血管發(fā)生嚴(yán)重病變。為了探究Aβ與腦微血管病變的關(guān)系,以及腦微血管病變與神經(jīng)元病變的關(guān)系,本文擬通過(guò)AD轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)及腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型進(jìn)行研究。淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)作為產(chǎn)生Aβ的唯一來(lái)源,希望通過(guò)深入研究APP和Aβ在腦微血管病變和神經(jīng)元病變中的作用,以及腦微血管病變?cè)贏D發(fā)病中的作用,揭示腦血管保護(hù)在AD治療中的重要作用。研究?jī)?nèi)容:(1)AD轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型的建立:利用斑馬魚(yú)appb啟動(dòng)子調(diào)控人APP瑞典型突變基因(APPsw),利用Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng),建立AD轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型,從基因和蛋白水平鑒定插入的人源APPsw的表達(dá),通過(guò)行為學(xué)和病理學(xué)驗(yàn)證該APPsw轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)能出現(xiàn)AD樣行為學(xué)和病理學(xué)變化。(2)選擇不同月齡的APPsw轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)動(dòng)態(tài)觀察腦部病理學(xué)變化:病理學(xué)檢測(cè)包括斑馬魚(yú)腦神經(jīng)元和腦血管超微結(jié)構(gòu)變化,斑馬魚(yú)腦神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量變化,腦中Aβ1-42含量變化,腦內(nèi)Claudin家族基因水平表達(dá)變化。(3)APP在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和功能研究:選擇原代培養(yǎng)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株b End.3作為研究對(duì)象,從基因和蛋白水平檢測(cè)APP的表達(dá)。建立過(guò)表達(dá)和敲低APP的細(xì)胞系,研究APP對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響;模擬腦內(nèi)缺糖缺氧環(huán)境,建立腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺糖缺氧模型,從基因和蛋白水平檢測(cè)APP的表達(dá)變化。研究結(jié)果:(1)AD轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型的建立:成功構(gòu)建了p Tol2-appb-APPsw-CMV-EGFP表達(dá)載體,通過(guò)顯微注射,熒光篩選,篩選出有熒光表達(dá)的斑馬魚(yú)品系。該品系斑馬魚(yú)熒光主要在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、眼睛、心臟和軀干血管表達(dá)。采用PCR和Western-blot檢測(cè)人源APP在斑馬魚(yú)體內(nèi)的表達(dá),利用胚胎整體免疫組化確定了APP的表達(dá)位置與EGFP熒光表達(dá)位置相同。T迷宮行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)12月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)最后一次試驗(yàn)尋找目標(biāo)區(qū)域營(yíng)養(yǎng)富集區(qū)(EC區(qū))的潛伏時(shí)間與首次試驗(yàn)的潛伏時(shí)間沒(méi)有顯著差異,而正常組和6月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)最后一次試驗(yàn)潛伏時(shí)間比首次試驗(yàn)潛伏時(shí)間顯著縮短(P0.01)。進(jìn)一步觀察斑馬魚(yú)自發(fā)活動(dòng),結(jié)果顯示12月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)行為異常,與正常斑馬魚(yú)相比活動(dòng)總距離增加,活動(dòng)時(shí)間增加,尋找頂部的潛伏時(shí)間減少,上下探索次數(shù)顯著增加(P0.05),并且停留在頂部時(shí)間顯著增加(P0.05)。HE染色結(jié)果顯示12月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)端腦及皮質(zhì)顆粒細(xì)胞排列疏松,細(xì)胞脫失嚴(yán)重;腦微血管周?chē)霈F(xiàn)明顯空洞。Aβ1-42免疫組化檢測(cè)Aβ1-42在腦內(nèi)沉積,尤其是在血管和血管周?chē)X實(shí)質(zhì)部位。以上結(jié)果提示我們成功建立了AD轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型,轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)能出現(xiàn)AD樣行為和病理學(xué)變化。(2)選擇不同月齡的APPsw轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)動(dòng)態(tài)觀察腦部病理學(xué)變化:利用透射電鏡動(dòng)態(tài)觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)神經(jīng)元和腦血管超微結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果顯示6月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)腦血管結(jié)構(gòu)開(kāi)始改變:血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,染色質(zhì)邊緣化,血管周?chē)�粒體、突觸小泡等細(xì)胞器減少,基底膜不光滑;9-12月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)血管結(jié)構(gòu)改變更明顯:血管內(nèi)皮細(xì)胞皺縮,基底膜不光滑,出現(xiàn)增厚、斷裂和松動(dòng)現(xiàn)象,血管周?chē)?xì)胞線粒體,突觸小泡等細(xì)胞器消失,出現(xiàn)空洞。9月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)開(kāi)始改變:細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,核膜皺縮,線粒體皺縮,線粒體嵴長(zhǎng)度變短,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹;12月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)改變更明顯:細(xì)胞核內(nèi)容物出現(xiàn)崩解破壞,線粒體腫脹,線粒體嵴缺失,出現(xiàn)空化狀。尼氏染色結(jié)果顯示,9月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)皮質(zhì)和端腦內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)量與正常斑馬魚(yú)相比減少,12月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)皮質(zhì)和端腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量減少更顯著(P0.01)。Aβ1-42免疫組化結(jié)果顯示3月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)腦皮質(zhì)有少量血管陽(yáng)性染色,6月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)皮質(zhì)陽(yáng)性染色血管增加,端腦中有少量血管有陽(yáng)性染色。9月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)皮質(zhì)大部分血管都有陽(yáng)性染色,有少量陽(yáng)性斑塊沉積在皮層和端腦。12月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)端腦在血管周?chē)霈F(xiàn)大量陽(yáng)性斑塊。q RT-PCR檢測(cè)claudin家族基因表達(dá)水平變化結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)腦內(nèi)claudin-2,claudin-5b,claudin-k基因表達(dá)顯著上調(diào),claudin-5a,claudin-11a,claudin-11b,claudin-h基因表達(dá)顯著下調(diào),并與轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)年齡呈正相關(guān)趨勢(shì)。以上結(jié)果提示6月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)血管上出現(xiàn)Aβ沉積導(dǎo)致血管超微結(jié)構(gòu)變化,隨著年齡增加,Aβ沉積增加,血管結(jié)構(gòu)被破壞,血腦屏障通透性改變,Aβ開(kāi)始在腦實(shí)質(zhì)沉積,影響神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷,導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡。(3)APP在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和功能研究:采用PCR、Western-blot和細(xì)胞免疫熒光方法,從基因和蛋白水平檢測(cè)APP在原代培養(yǎng)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株b End.3的表達(dá)。成功構(gòu)建APP/APPsw過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3-APP/APPsw-IRES-EGFP,以及sh RNA質(zhì)粒p GPU6/m RFP/Neo-sh APP。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染b End.3細(xì)胞,采用熒光分選的方法篩選熒光表達(dá)細(xì)胞。利用PCR和Western-blot檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。MTT檢測(cè)細(xì)胞活力,結(jié)果顯示敲除APP組細(xì)胞活力與NC組相比,細(xì)胞活力顯著下降(P0.01)。APP/APPsw過(guò)表達(dá)組細(xì)胞活力與NC組相比,無(wú)明顯差異(P0.05)。原子力顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后b End.3細(xì)胞的形態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)敲除APP組細(xì)胞膜表面凹凸不平,細(xì)胞周?chē)灰?guī)則,細(xì)胞表面高度顯著增加(P0.01)。建立b End.3腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺糖缺氧模型,MTT檢測(cè)不同缺糖缺氧時(shí)間細(xì)胞活力變化。結(jié)果顯示,隨著缺氧缺糖時(shí)間增加,b End.3細(xì)胞活性降低,細(xì)胞大量死亡。利用q RT-PCR和Western-blot檢測(cè)APP表達(dá),結(jié)果顯示缺糖缺氧16h和24h的b End.3細(xì)胞,與缺糖缺氧4h的細(xì)胞相比,APP表達(dá)水平增高,16h細(xì)胞差異具有顯著性(P0.05)。以上結(jié)果提示:腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠表達(dá)APP。敲除APP基因會(huì)影響微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu),影響細(xì)胞膜功能,導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡。缺糖缺氧引起的微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷會(huì)使APP蛋白和基因表達(dá)水平增加。結(jié)論:血管表達(dá)APP能產(chǎn)生的Aβ,Aβ可以在血管沉積引起血管結(jié)構(gòu)改變,影響血腦屏障通透性,進(jìn)而累及神經(jīng)血管單元,引起神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞死亡。最終造成認(rèn)知功能障礙,癡呆的發(fā)生。因此,腦微血管Aβ沉積過(guò)多造成腦微血管病變是AD發(fā)生的先兆或促進(jìn)因素。提示減少Aβ在微血管的沉積以及改善和保護(hù)腦微血管功能,是延緩AD發(fā)生和發(fā)展策略的一個(gè)重要組成部分。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：1284438