本文關(guān)鍵詞：巴弗洛霉素A1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡機(jī)制的研究

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【摘要】：目的:原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一,居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率的第三位,死亡率的第二位。由于原發(fā)性肝癌發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速,90%以上的患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期。因此,肝癌病人手術(shù)切除率低,即使接受手術(shù),復(fù)發(fā)率也較高。目前常用的肝癌化療藥物敏感性差、毒副作用大,而且多數(shù)病人合并肝硬化,耐受性差,治療效果不佳。因此,尋找高效、副作用小的藥物具有重要的臨床意義。巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1,BafA1)是一種特異性囊泡型H+-ATP酶(V-ATPase)抑制劑,屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,常以高濃度(0.1-1μM)用作自噬晚期抑制劑。已發(fā)現(xiàn)BafA1對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,然而為了有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及抑制細(xì)胞自噬,通常需要較高濃度(0.1-1μM),進(jìn)而導(dǎo)致正常組織發(fā)生嚴(yán)重的酸中毒,產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用,這阻礙了Baf A1在腫瘤臨床治療中的應(yīng)用。本課題旨在研究5nM BafA1對(duì)肝癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)性治療作用,并深入探討其具體作用分子機(jī)制,為BafA1成為肝癌治療的靶向新藥的進(jìn)一步研究提供研究基礎(chǔ)及理論依據(jù)。本項(xiàng)研究擬解決以下三個(gè)問(wèn)題:(1)明確5nM BafA1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用;(2)確定BafA1對(duì)活體肝癌皮下移植瘤裸鼠模型的治療作用;(3)探討B(tài)afA1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的具體分子機(jī)制。方法:1、BafA1對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用應(yīng)用MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在二維培養(yǎng)條件下5nM BafA1對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,通過(guò)細(xì)胞微球形成實(shí)驗(yàn)在三維培養(yǎng)條件下檢測(cè)5nmbafa1對(duì)肝癌細(xì)胞微球形成的影響及對(duì)微球細(xì)胞的毒性作用。2、bafa1對(duì)裸鼠皮下肝癌細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用裸鼠皮下注射肝癌細(xì)胞建立皮下移植瘤裸鼠模型。建模成功的裸鼠分四組:對(duì)照組,jnk抑制劑組,bafa1組,bafa1與jnk抑制劑聯(lián)用組,根據(jù)腫瘤體積確定bafa1對(duì)裸鼠皮下肝癌細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用。另外,取治療后腫瘤組織,石蠟切片,進(jìn)行he染色和tunel染色,分析bafa1對(duì)腫瘤組織產(chǎn)生的病理改變。3、bafa1對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)pi單染法檢測(cè)bafa1對(duì)細(xì)胞周期分布的影響,蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的變化,應(yīng)用抑制劑抑制、sirna干擾的手段,通過(guò)蛋白免疫印跡檢測(cè)cyclind1表達(dá)水平的變化以及mtt法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,明確bafa1引起肝癌細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制。4、bafa1對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)bafa1對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響、免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白caspase-3激活、parp剪切,泛caspase抑制劑抑制后觀察凋亡變化,探討bafa1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的類型,同時(shí)通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)抑凋亡蛋白以及促凋亡蛋白的水平。5、bafa1對(duì)肝癌細(xì)胞自噬的影響應(yīng)用蛋白免疫印跡法、透射電鏡、共聚焦顯微鏡,分別用gfp-lc3質(zhì)粒及雙標(biāo)gfp-mrfp-lc3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定敲低lc3的肝癌細(xì)胞系及mtt法等方法探討5nmbafa1對(duì)細(xì)胞自噬的影響及如何靶向自噬誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的。6、bafa1誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所靶向的信號(hào)通路應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測(cè)mapk信號(hào)通路變化、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mapk抑制劑處理后細(xì)胞凋亡變化、mtt法檢測(cè)慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定敲低p38的肝癌細(xì)胞系、腺病毒過(guò)表達(dá)p38后細(xì)胞存活情況,探討bafa1作用肝癌細(xì)胞后mapk通路的變化,bafa1靶向的信號(hào)通路及mapk通路調(diào)控肝癌細(xì)胞死亡的具體機(jī)制。結(jié)果:1、5nmbafa1顯著抑制多種人肝癌細(xì)胞系生長(zhǎng)和克隆形成,而對(duì)正常肝細(xì)胞無(wú)影響。bafa1作用后,肝癌細(xì)胞不能形成細(xì)胞微球;若形成微球后再用bafa1處理,隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞微球的數(shù)量和體積均減小,并且肝癌細(xì)胞微球內(nèi)出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞。2、bafa1對(duì)裸鼠皮下肝癌移植瘤的生長(zhǎng)有明顯抑制作用,并且與jnk抑制劑聯(lián)用進(jìn)一步增強(qiáng)這一治療效果。單獨(dú)bafa1處理或聯(lián)合jnk抑制劑處理組的腫瘤組織中出現(xiàn)更多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞死亡。3、bafa1將肝癌細(xì)胞阻滯在g1期,下調(diào)了細(xì)胞周期正調(diào)控因子cyclind1、cdc6和prb的表達(dá)水平,并且腺病毒過(guò)表達(dá)cyclind1減弱了bafa1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制,表明cyclind1的降解在bafa1抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。另外,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)bafa1引起的cyclind1降解依賴于dyrk1b,而與gsk3β無(wú)關(guān)。4、bafa1能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,但未檢測(cè)到經(jīng)典凋亡標(biāo)志蛋白caspase-3的活化和parp的裂解,并且泛caspase抑制劑z-vad-fmk對(duì)bafa1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并無(wú)明顯影響。因此,bafa1可能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生caspase非依賴型細(xì)胞凋亡。bafa1同時(shí)下調(diào)bcl2蛋白家族中的抑凋亡蛋白bcl2、bcl-xl的表達(dá)和促凋亡蛋白bax、bid及bim的表達(dá),但puma的表達(dá)上調(diào)。5、bafa1常以高濃度用作自噬晚期抑制劑。本課題發(fā)現(xiàn),bafa1除了能夠通過(guò)阻滯自噬體與溶酶體的融合抑制晚期自噬外,還能通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞系i型pi3k/akt/mtor/p70s6k信號(hào)通路的活化,誘導(dǎo)細(xì)胞早期自噬。并且發(fā)現(xiàn),抑制自噬體形成減弱bafa1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡。表明bafa1靶向自噬誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡。6、除了通過(guò)靶向自噬,bafa1還通過(guò)靶向p38mapk信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。bafa1處理肝癌細(xì)胞后,mapk三條主要通路均發(fā)生活化。抑制jnk的表達(dá)可顯著增強(qiáng)bafa1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡,表明bafa1與jnk抑制劑聯(lián)用可能成為肝癌治療的潛在方案。另外,藥物抑制或者穩(wěn)定敲低p38顯著減少bafa1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡。p38抑制劑還可以阻礙bafa1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞中puma水平的上調(diào)。敲低puma減弱bafa1產(chǎn)生的細(xì)胞毒性,相反過(guò)表達(dá)puma使bafa1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用明顯增強(qiáng),暗示p38通過(guò)調(diào)控puma水平來(lái)調(diào)控bafa1介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。結(jié)論:納摩爾級(jí)濃度的BafA1能夠顯著抑制二維、三維培養(yǎng)條件下以及小鼠移植瘤模型中HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)。BafA1通過(guò)靶向自噬和MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)非依賴caspase的肝癌細(xì)胞死亡。BafA1是一種肝癌治療的候選藥物,具有很高的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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2 韓志偉;張秀娟;;胸腺肽a1治療慢性重型乙型肝炎的意義[J];黑龍江醫(yī)藥;2006年05期

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6 陸安偉,林群,唐建軍,雍思勇,紀(jì)剛;Ⅰ_(A1)期宮頸癌經(jīng)陰道根治性宮頸切除術(shù)6例臨床分析[J];中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志;2005年07期

7 劉恒方;楊期東;苗旺;齊尚書;董洪林;宋喜明;何庚山;張福全;;三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn)轉(zhuǎn)體A1與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的關(guān)系[J];中華神經(jīng)科雜志;2007年03期

8 梁楠;劉濱;范海濤;辛濤;郭華;劉威;趙光宇;欒立明;許尚臣;龐琦;;多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者高遷移率蛋白A1表達(dá)與復(fù)發(fā)時(shí)間的關(guān)系[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年04期

9 黃錚人,李明珍,陳雪英;自體骨髓移植治療急性粒細(xì)胞白血病M_(2a)生存11a1例[J];白血病.淋巴瘤;2004年01期

10 鄖曉靜;胡玉燕;羨曉輝;李淑琴;孫曉彩;張敏;李清君;李文斌;;大鼠側(cè)腦室注射腺苷A1受體反義寡聚脫氧核苷酸抑制腦缺血耐受的誘導(dǎo)[J];中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志;2008年04期

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3 向飛;張瓊;褚志剛;黃躍生;;蛋白激酶C在腺苷A1受體調(diào)控缺氧心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放中的表達(dá)和作用[A];第八屆全國(guó)燒傷外科學(xué)年會(huì)論文匯編[C];2007年

4 黃志榮;;日達(dá)仙(胸腺肽a1)治療慢性重型乙型肝炎臨床研究[A];2005年浙江省感染病、肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

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7 柯艷蓉;金宏威;劉振明;張亮仁;;腺苷A1受體的同源模擬和分子對(duì)接研究[A];第十屆全國(guó)計(jì)算(機(jī))化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

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9 何靖康;顧振綸;周文軒;郭次儀;;前列腺素A1對(duì)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第八次全國(guó)代表大會(huì)論文摘要集（第二部分）[C];2002年

10 蔣學(xué)誠(chéng);董兆楨;陳婉如;;超塑性Zn——22A1擠壓成形及模具設(shè)計(jì)[A];工模具設(shè)計(jì)與制造資料匯編[C];1980年

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1 本報(bào)記者 黃嘉瑩;科法斯維持香港A1貿(mào)易風(fēng)險(xiǎn)評(píng)級(jí)[N];中國(guó)貿(mào)易報(bào);2008年

2 記者　 張春兵;A1汽車大獎(jiǎng)賽亮相上海[N];上海金融報(bào);2006年

3 本報(bào)記者 寇建東;擺脫“官車”形象 奧迪A1新?lián)?dāng)[N];華夏時(shí)報(bào);2011年

4 本報(bào)記者 管宏業(yè);小A1展露奧迪大不同[N];中國(guó)商報(bào);2011年

5 黃莉 余前明;江西局中標(biāo)肯尼亞A1公路項(xiàng)目[N];中煤地質(zhì)報(bào);2012年

6 記者 錢玉和 楊寶勝;昆明中北集團(tuán) 開通A1路公交專線[N];云南經(jīng)濟(jì)日?qǐng)?bào);2008年

7 本報(bào)記者 高薇;奧迪A1正式投產(chǎn) 明年或?qū)⑦M(jìn)中國(guó)[N];華夏時(shí)報(bào);2010年

8 本報(bào)記者 陳浩;目標(biāo)成都,A1呼嘯而來(lái)[N];成都日?qǐng)?bào);2008年

9 陳顯英 鄭曉利;會(huì)昌湖水上公園A1段景區(qū)開園[N];溫州日?qǐng)?bào);2005年

10 王喧;惠普Designjet 4000 打一張A1只需25秒[N];中國(guó)計(jì)算機(jī)報(bào);2005年

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1 袁娜;巴弗洛霉素A1實(shí)驗(yàn)治療兒童B-急性淋巴細(xì)胞白血病[D];蘇州大學(xué);2015年

2 閆玉梅;巴弗洛霉素A1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡機(jī)制的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2017年

3 梁博偉;沉默膜聯(lián)蛋白A1對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞生物特性的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

4 郭盛珍;A1型短指（趾）癥致病基因IHH的體外功能研究及精神分裂癥關(guān)聯(lián)分析[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2006年

5 楊培龍;來(lái)源于橄欖綠鏈霉菌A1的高比活木聚糖酶在植物中的高效表達(dá)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2005年

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1 謝文q;巴弗洛霉素A1對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用及增強(qiáng)其對(duì)5-氟尿嘧啶敏感性的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 馬春飛;應(yīng)用絲氨酸蛋白酶抑制劑A1預(yù)測(cè)前列腺癌內(nèi)分泌治療敏感性的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

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4 段學(xué)靜;核心結(jié)合因子a1及骨形成相關(guān)蛋白在人牙胚發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)[D];山東大學(xué);2006年

5 張巍巍;注射用重組人胸腺肽a1免疫藥效學(xué)及抗腫瘤藥效學(xué)的初步研究[D];吉林大學(xué);2007年

6 盧獻(xiàn)靈;慢性阻塞性肺疾�。–OPD）大鼠肺組織腺苷A1受體的表達(dá)及糖皮質(zhì)激素、抗膽堿藥的干預(yù)作用[D];四川大學(xué);2004年

7 呂技能;香魚a1-抗胰蛋白酶與急性期反應(yīng)的相關(guān)性研究[D];寧波大學(xué);2012年

8 沈飛;人血管性血友病因子A1區(qū)單克隆抗體的制備和應(yīng)用研究[D];蘇州大學(xué);2009年

9 張敏;膜聯(lián)蛋白A1的表達(dá)差異同乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的初步研究[D];蘭州大學(xué);2006年

10 王亞哲;準(zhǔn)—維雙連通A1超導(dǎo)體的低溫物性研究[D];浙江大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1283099