發(fā)布時間：2017-12-12 16:07

  本文關(guān)鍵詞：巴弗洛霉素A1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡機制的研究

  更多相關(guān)文章： 原發(fā)性肝癌 巴弗洛霉素A1 自噬 凋亡 MAPK信號通路

【摘要】：目的:原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,居我國惡性腫瘤發(fā)病率的第三位,死亡率的第二位。由于原發(fā)性肝癌發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速,90%以上的患者確診時已處于進(jìn)展期。因此,肝癌病人手術(shù)切除率低,即使接受手術(shù),復(fù)發(fā)率也較高。目前常用的肝癌化療藥物敏感性差、毒副作用大,而且多數(shù)病人合并肝硬化,耐受性差,治療效果不佳。因此,尋找高效、副作用小的藥物具有重要的臨床意義。巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1,BafA1)是一種特異性囊泡型H+-ATP酶(V-ATPase)抑制劑,屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,常以高濃度(0.1-1μM)用作自噬晚期抑制劑。已發(fā)現(xiàn)BafA1對多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,然而為了有效抑制腫瘤細(xì)胞生長及抑制細(xì)胞自噬,通常需要較高濃度(0.1-1μM),進(jìn)而導(dǎo)致正常組織發(fā)生嚴(yán)重的酸中毒,產(chǎn)生較強的毒副作用,這阻礙了Baf A1在腫瘤臨床治療中的應(yīng)用。本課題旨在研究5nM BafA1對肝癌細(xì)胞的實驗性治療作用,并深入探討其具體作用分子機制,為BafA1成為肝癌治療的靶向新藥的進(jìn)一步研究提供研究基礎(chǔ)及理論依據(jù)。本項研究擬解決以下三個問題:(1)明確5nM BafA1對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用;(2)確定BafA1對活體肝癌皮下移植瘤裸鼠模型的治療作用;(3)探討B(tài)afA1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的具體分子機制。方法:1、BafA1對肝癌細(xì)胞的生長抑制作用應(yīng)用MTT法及克隆形成實驗檢測在二維培養(yǎng)條件下5nM BafA1對肝癌細(xì)胞生長的影響,通過細(xì)胞微球形成實驗在三維培養(yǎng)條件下檢測5nmbafa1對肝癌細(xì)胞微球形成的影響及對微球細(xì)胞的毒性作用。2、bafa1對裸鼠皮下肝癌細(xì)胞移植瘤的生長抑制作用裸鼠皮下注射肝癌細(xì)胞建立皮下移植瘤裸鼠模型。建模成功的裸鼠分四組:對照組,jnk抑制劑組,bafa1組,bafa1與jnk抑制劑聯(lián)用組,根據(jù)腫瘤體積確定bafa1對裸鼠皮下肝癌細(xì)胞移植瘤的生長抑制作用。另外,取治療后腫瘤組織,石蠟切片,進(jìn)行he染色和tunel染色,分析bafa1對腫瘤組織產(chǎn)生的病理改變。3、bafa1對細(xì)胞周期的調(diào)控應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)pi單染法檢測bafa1對細(xì)胞周期分布的影響,蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的變化,應(yīng)用抑制劑抑制、sirna干擾的手段,通過蛋白免疫印跡檢測cyclind1表達(dá)水平的變化以及mtt法檢測細(xì)胞增殖情況,明確bafa1引起肝癌細(xì)胞周期阻滯的機制。4、bafa1對肝癌細(xì)胞凋亡的影響使用流式細(xì)胞術(shù)檢測bafa1對肝癌細(xì)胞凋亡的影響、免疫印跡檢測細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白caspase-3激活、parp剪切,泛caspase抑制劑抑制后觀察凋亡變化,探討bafa1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的類型,同時通過免疫印跡法檢測抑凋亡蛋白以及促凋亡蛋白的水平。5、bafa1對肝癌細(xì)胞自噬的影響應(yīng)用蛋白免疫印跡法、透射電鏡、共聚焦顯微鏡,分別用gfp-lc3質(zhì)粒及雙標(biāo)gfp-mrfp-lc3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定敲低lc3的肝癌細(xì)胞系及mtt法等方法探討5nmbafa1對細(xì)胞自噬的影響及如何靶向自噬誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的。6、bafa1誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所靶向的信號通路應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測mapk信號通路變化、流式細(xì)胞術(shù)檢測mapk抑制劑處理后細(xì)胞凋亡變化、mtt法檢測慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定敲低p38的肝癌細(xì)胞系、腺病毒過表達(dá)p38后細(xì)胞存活情況,探討bafa1作用肝癌細(xì)胞后mapk通路的變化,bafa1靶向的信號通路及mapk通路調(diào)控肝癌細(xì)胞死亡的具體機制。結(jié)果:1、5nmbafa1顯著抑制多種人肝癌細(xì)胞系生長和克隆形成,而對正常肝細(xì)胞無影響。bafa1作用后,肝癌細(xì)胞不能形成細(xì)胞微球;若形成微球后再用bafa1處理,隨著作用時間延長細(xì)胞微球的數(shù)量和體積均減小,并且肝癌細(xì)胞微球內(nèi)出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞。2、bafa1對裸鼠皮下肝癌移植瘤的生長有明顯抑制作用,并且與jnk抑制劑聯(lián)用進(jìn)一步增強這一治療效果。單獨bafa1處理或聯(lián)合jnk抑制劑處理組的腫瘤組織中出現(xiàn)更多的炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞死亡。3、bafa1將肝癌細(xì)胞阻滯在g1期,下調(diào)了細(xì)胞周期正調(diào)控因子cyclind1、cdc6和prb的表達(dá)水平,并且腺病毒過表達(dá)cyclind1減弱了bafa1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞生長抑制,表明cyclind1的降解在bafa1抑制肝癌細(xì)胞生長中起關(guān)鍵作用。另外,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)bafa1引起的cyclind1降解依賴于dyrk1b,而與gsk3β無關(guān)。4、bafa1能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,但未檢測到經(jīng)典凋亡標(biāo)志蛋白caspase-3的活化和parp的裂解,并且泛caspase抑制劑z-vad-fmk對bafa1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并無明顯影響。因此,bafa1可能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生caspase非依賴型細(xì)胞凋亡。bafa1同時下調(diào)bcl2蛋白家族中的抑凋亡蛋白bcl2、bcl-xl的表達(dá)和促凋亡蛋白bax、bid及bim的表達(dá),但puma的表達(dá)上調(diào)。5、bafa1常以高濃度用作自噬晚期抑制劑。本課題發(fā)現(xiàn),bafa1除了能夠通過阻滯自噬體與溶酶體的融合抑制晚期自噬外,還能通過抑制肝癌細(xì)胞系i型pi3k/akt/mtor/p70s6k信號通路的活化,誘導(dǎo)細(xì)胞早期自噬。并且發(fā)現(xiàn),抑制自噬體形成減弱bafa1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡。表明bafa1靶向自噬誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡。6、除了通過靶向自噬,bafa1還通過靶向p38mapk信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。bafa1處理肝癌細(xì)胞后,mapk三條主要通路均發(fā)生活化。抑制jnk的表達(dá)可顯著增強bafa1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡,表明bafa1與jnk抑制劑聯(lián)用可能成為肝癌治療的潛在方案。另外,藥物抑制或者穩(wěn)定敲低p38顯著減少bafa1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡。p38抑制劑還可以阻礙bafa1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞中puma水平的上調(diào)。敲低puma減弱bafa1產(chǎn)生的細(xì)胞毒性,相反過表達(dá)puma使bafa1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞生長抑制作用明顯增強,暗示p38通過調(diào)控puma水平來調(diào)控bafa1介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。結(jié)論:納摩爾級濃度的BafA1能夠顯著抑制二維、三維培養(yǎng)條件下以及小鼠移植瘤模型中HCC細(xì)胞的生長。BafA1通過靶向自噬和MAPK信號通路誘導(dǎo)非依賴caspase的肝癌細(xì)胞死亡。BafA1是一種肝癌治療的候選藥物,具有很高的研究價值和應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳萍萍,吳逸明,張朝武,吳擁軍;人谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶A1真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及序列分析[J];環(huán)境與健康雜志;2003年03期

2 韓志偉;張秀娟;;胸腺肽a1治療慢性重型乙型肝炎的意義[J];黑龍江醫(yī)藥;2006年05期

3 潘新元;梁博偉;趙勁民;殷國前;;膜聯(lián)蛋白A1在兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成骨和成脂早期的表達(dá)[J];中國組織工程研究;2012年23期

4 韓詩卉;;胸腺肽a1注射液過敏1例[J];臨床肺科雜志;2011年03期

5 滕志朋;王晨;劉斌;李昱;;肝X受體-β和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)和意義[J];中國生物制品學(xué)雜志;2012年08期

6 陸安偉,林群,唐建軍,雍思勇,紀(jì)剛;Ⅰ_(A1)期宮頸癌經(jīng)陰道根治性宮頸切除術(shù)6例臨床分析[J];中國實用婦科與產(chǎn)科雜志;2005年07期

7 劉恒方;楊期東;苗旺;齊尚書;董洪林;宋喜明;何庚山;張福全;;三磷酸腺苷結(jié)合盒運轉(zhuǎn)體A1與頸動脈粥樣硬化斑塊的關(guān)系[J];中華神經(jīng)科雜志;2007年03期

8 梁楠;劉濱;范海濤;辛濤;郭華;劉威;趙光宇;欒立明;許尚臣;龐琦;;多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者高遷移率蛋白A1表達(dá)與復(fù)發(fā)時間的關(guān)系[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年04期

9 黃錚人,李明珍,陳雪英;自體骨髓移植治療急性粒細(xì)胞白血病M_(2a)生存11a1例[J];白血病.淋巴瘤;2004年01期

10 鄖曉靜;胡玉燕;羨曉輝;李淑琴;孫曉彩;張敏;李清君;李文斌;;大鼠側(cè)腦室注射腺苷A1受體反義寡聚脫氧核苷酸抑制腦缺血耐受的誘導(dǎo)[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2008年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 沈飛;董寧征;范磊;趙益明;謝麗倩;阮長耿;;人血管性血友病因子A1區(qū)單克隆抗體的研制[A];第十一屆全國血栓與止血學(xué)術(shù)會議暨血栓栓塞性疾�。ㄑㄅc止血）基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文摘要匯編及學(xué)習(xí)班講義[C];2007年

2 沈飛;董寧征;趙益明;謝麗倩;范磊;阮長耿;;人血管性血友病因子A1區(qū)單克隆抗體的生物學(xué)效應(yīng)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會第十三屆全國血栓與止血學(xué)術(shù)會議暨“血栓栓塞性疾�。ㄑㄅc止血）基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展”論文摘要匯編及學(xué)習(xí)班講義[C];2011年

3 向飛;張瓊;褚志剛;黃躍生;;蛋白激酶C在腺苷A1受體調(diào)控缺氧心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放中的表達(dá)和作用[A];第八屆全國燒傷外科學(xué)年會論文匯編[C];2007年

4 黃志榮;;日達(dá)仙(胸腺肽a1)治療慢性重型乙型肝炎臨床研究[A];2005年浙江省感染病、肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

5 ;北京市勞動和社會保障局關(guān)于北京市政協(xié)第十屆一次會議第0607號提案的辦理報告(A1)[A];首屆全國重點醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科主任論壇論文匯編[C];2004年

6 高建明;夏卜賢;羅峰;裴忠有;孫守鈞;;高粱A1型細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因分子標(biāo)記輔助選擇及應(yīng)用[A];中國作物學(xué)會50周年慶祝會暨2011年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2011年

7 柯艷蓉;金宏威;劉振明;張亮仁;;腺苷A1受體的同源模擬和分子對接研究[A];第十屆全國計算(機)化學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

8 石偉群;劉雅蘭;劉奎;張密林;韓偉;何輝;葉國安;柴之芳;;基于活性A1陰極的鑭錒干法分離研究[A];第十三屆全國核化學(xué)與放射化學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2014年

9 何靖康;顧振綸;周文軒;郭次儀;;前列腺素A1對大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響[A];中國藥理學(xué)會第八次全國代表大會論文摘要集（第二部分）[C];2002年

10 蔣學(xué)誠;董兆楨;陳婉如;;超塑性Zn——22A1擠壓成形及模具設(shè)計[A];工模具設(shè)計與制造資料匯編[C];1980年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 本報記者 黃嘉瑩;科法斯維持香港A1貿(mào)易風(fēng)險評級[N];中國貿(mào)易報;2008年

2 記者　 張春兵;A1汽車大獎賽亮相上海[N];上海金融報;2006年

3 本報記者 寇建東;擺脫“官車”形象 奧迪A1新?lián)?dāng)[N];華夏時報;2011年

4 本報記者 管宏業(yè);小A1展露奧迪大不同[N];中國商報;2011年

5 黃莉 余前明;江西局中標(biāo)肯尼亞A1公路項目[N];中煤地質(zhì)報;2012年

6 記者 錢玉和 楊寶勝;昆明中北集團(tuán) 開通A1路公交專線[N];云南經(jīng)濟(jì)日報;2008年

7 本報記者 高薇;奧迪A1正式投產(chǎn) 明年或?qū)⑦M(jìn)中國[N];華夏時報;2010年

8 本報記者 陳浩;目標(biāo)成都,A1呼嘯而來[N];成都日報;2008年

9 陳顯英 鄭曉利;會昌湖水上公園A1段景區(qū)開園[N];溫州日報;2005年

10 王喧;惠普Designjet 4000 打一張A1只需25秒[N];中國計算機報;2005年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 袁娜;巴弗洛霉素A1實驗治療兒童B-急性淋巴細(xì)胞白血病[D];蘇州大學(xué);2015年

2 閆玉梅;巴弗洛霉素A1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡機制的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2017年

3 梁博偉;沉默膜聯(lián)蛋白A1對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞生物特性的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

4 郭盛珍;A1型短指（趾）癥致病基因IHH的體外功能研究及精神分裂癥關(guān)聯(lián)分析[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2006年

5 楊培龍;來源于橄欖綠鏈霉菌A1的高比活木聚糖酶在植物中的高效表達(dá)[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2005年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 謝文q;巴弗洛霉素A1對胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用及增強其對5-氟尿嘧啶敏感性的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 馬春飛;應(yīng)用絲氨酸蛋白酶抑制劑A1預(yù)測前列腺癌內(nèi)分泌治療敏感性的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 楊鳳;腺苷A1和A2A受體在酒精性肝纖維化大鼠HSC模型中的作用及兩者間的相互作用研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

4 段學(xué)靜;核心結(jié)合因子a1及骨形成相關(guān)蛋白在人牙胚發(fā)育過程中的表達(dá)[D];山東大學(xué);2006年

5 張巍巍;注射用重組人胸腺肽a1免疫藥效學(xué)及抗腫瘤藥效學(xué)的初步研究[D];吉林大學(xué);2007年

6 盧獻(xiàn)靈;慢性阻塞性肺疾�。–OPD）大鼠肺組織腺苷A1受體的表達(dá)及糖皮質(zhì)激素、抗膽堿藥的干預(yù)作用[D];四川大學(xué);2004年

7 呂技能;香魚a1-抗胰蛋白酶與急性期反應(yīng)的相關(guān)性研究[D];寧波大學(xué);2012年

8 沈飛;人血管性血友病因子A1區(qū)單克隆抗體的制備和應(yīng)用研究[D];蘇州大學(xué);2009年

9 張敏;膜聯(lián)蛋白A1的表達(dá)差異同乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的初步研究[D];蘭州大學(xué);2006年

10 王亞哲;準(zhǔn)—維雙連通A1超導(dǎo)體的低溫物性研究[D];浙江大學(xué);2013年

，

本文編號：1283099