本文關(guān)鍵詞：調(diào)控mTOR信號通路和神經(jīng)活動促進脊髓損傷后軸突再生的實驗研究

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【摘要】：作為全球青壯年人群重要的致殘原因,脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)一直以來都是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的重點和難點,也是亟待有效治療手段的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerves system,CNS)損傷性疾病之一。從脊髓損傷的病理機制來講,損傷造成的神經(jīng)傳導(dǎo)束斷裂-軸突(axon)斷裂,大腦與脊髓失去信息聯(lián)系無疑是導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下感覺運動功能障礙的主要原因之一。因此,如何促進受損神經(jīng)纖維的軸突再生(axon regeneration),恢復(fù)腦-脊髓之間的信息聯(lián)系是治療脊髓損傷的重要突破口。研究表明,軸突再生主要受到以下兩方面因素的影響:(1)損傷局部的抑制性微環(huán)境,如髓鞘相關(guān)抑制因子(Myelin-associated inhibitors,MAIs),硫酸軟骨素蛋白多糖(Chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs),膠質(zhì)瘢痕(glia scar)等。(2)減弱的成體神經(jīng)元內(nèi)在再生能力。通過調(diào)控外源性抑制因素,比如敲除Nogo、促進CSPGs的降解等方式,發(fā)現(xiàn)脊髓損傷動物的再生能力有所增加、軸突可塑性增強,部分研究甚至觀察到小鼠具有更好的行為學(xué)表現(xiàn)。但是,在這些針對局部抑制因素的調(diào)控措施中,很少觀察到長距離(1 mm)的軸突再生。而且,調(diào)控外源性因素對控制隨意運動最重要的傳導(dǎo)束-皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tract,CST)的再生影響有限。另外,增強的神經(jīng)可塑性和出芽再生也能夠在一定的康復(fù)訓(xùn)練策略中獲得。以上研究提示,提高中樞神經(jīng)元的內(nèi)源性再生能力可能更為重要。研究發(fā)現(xiàn),敲除Pten(phosphatase and tensin homolog,磷酸酶及張力蛋白同源物)基因能夠提高神經(jīng)元的的內(nèi)源性軸突再生能力。Pten是一種腫瘤抑制基因,具有脂質(zhì)和蛋白磷酸酶兩種活性,對PI3K/AKT/m TOR(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,m TOR)具有負調(diào)控作用。m TOR通路的激活幾乎都能夠改變目前所有已知的細胞代謝狀況,促進生長所必須的結(jié)構(gòu)單位和大分子物質(zhì)的合成,在接受細胞生長信號刺激和調(diào)控細胞代謝狀態(tài)過程中起了核心控制作用。m TOR不僅可以被營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子或特定的細胞環(huán)境所激活,其活性也隨著CNS的發(fā)育(視神經(jīng)節(jié)細胞、皮質(zhì)神經(jīng)元)完成而下調(diào)。條件性敲除視神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell,RGC)的Pten基因可以促進鉗夾損傷的視神經(jīng)軸突出現(xiàn)明顯的再生反應(yīng)。激活的m TOR信號通路還有效的減少了由損傷引起的RGC細胞死亡。同樣,在脊髓損傷模型中也發(fā)現(xiàn)條件性敲除皮質(zhì)神經(jīng)元的Pten基因能夠促進皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tract,CST)的軸突再生,隨后,該方法被越來越多的實驗室重復(fù)并且證實有效,成為調(diào)控再生內(nèi)源性因素的核心分子通路。但是在以往這些針對PTEN和m TOR的再生研究中,學(xué)者們大多采用轉(zhuǎn)基因小鼠(將目的基因插入Lox P位點之間,以實現(xiàn)條件性敲除)作為研究對象;由于起始表達時間較慢,攜帶Cre同源重組酶的腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)也需要在損傷之前數(shù)周(一般四周,甚至更長時間)注射到感覺運動皮質(zhì)。RNA干擾(RNAi)作為有效沉默或抑制目標基因表達的方式已經(jīng)被廣泛運用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中。但是,在活體研究中,Sh RNA和Si RNA都需要鉚定于相應(yīng)的病毒載體上。而目前感染非分裂細胞(皮質(zhì)神經(jīng)元)的慢病毒和腺相關(guān)病毒存在持續(xù)表達、基因組整合等不確定的風險,加之Pten持續(xù)敲除增加了發(fā)生腫瘤、癲癇等風險。這些問題的存在限制了調(diào)控內(nèi)源性再生能力以促進軸突再生、治療脊髓損傷的臨床轉(zhuǎn)化可能�；贖IV-1的Tat的蛋白降解肽-Degron是一種能夠有效、快速、可逆的誘導(dǎo)細胞內(nèi)目標蛋白降解,實現(xiàn)蛋白水平調(diào)節(jié)的干預(yù)方式。該肽段包含三個部分:Tat結(jié)構(gòu)域,負責穿膜;蛋白結(jié)合域,負責與目標蛋白結(jié)合;降解誘導(dǎo)序列。研究顯示,利用該方法敲減(death associated protein kinase 1,DAPK1)并誘導(dǎo)神經(jīng)保護作用。而且,最近一項利用該方法NA-1降解肽的研究(目標蛋白為PSD95,敲減后有神經(jīng)保護作用)在92例腦卒中患者中做了II期的臨床試驗,初步證明本方法安全有效。因此,該方法有望成為調(diào)控體內(nèi)靶標蛋白表達的重要備選方式,逐漸受到關(guān)注。本研究中,我們設(shè)計了特異性的針對PTEN的降解肽,并在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和脊髓損傷模型中驗證了該Degron對軸突再生的促進作用。最后我們將探討在敲除Pten激活m TOR信號通路的基礎(chǔ)上利用化學(xué)遺傳學(xué)方法提高神經(jīng)活動對脊髓損傷小鼠軸突再生的促進作用和功能恢復(fù)作用。主要方法:1、利用自行設(shè)計的鉗夾鉗制備小鼠頸5(C5)脊髓鉗夾損傷模型;使用圓筒試驗、水平樓梯、梳理測試、廂式食物抓取試驗、BMS評分等方式評價C5脊髓鉗夾傷模型小鼠的行為學(xué)特點;利用免疫熒光法檢測脊髓損傷局部GFAP、CSPGs、Iba-1、MAG、Nogo-A等抑制性蛋白和膠質(zhì)激活情況;使用順行示蹤法評價控制隨意運動的皮質(zhì)脊髓束、紅核脊髓束在損傷后的情況;使用逆行示蹤法分析SCI后皮質(zhì)神經(jīng)元和紅核神經(jīng)元m TOR通路的活性。2、根據(jù)文獻,設(shè)計、合成針對PTEN蛋白的Degron;建立體外培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRG)并驗證;使用WB檢測PTEN Degron對培養(yǎng)神經(jīng)元PTEN蛋白的敲減情況;使用免疫熒光檢測PTEN Degron對神經(jīng)元突起的生長情況和m TOR通路的激活情況;制備人工CSPGs抑制性微環(huán)境,檢測PTEN Degron對DRG生長的刺激作用。3、利用皮質(zhì)局部注射和微量泵持續(xù)泵入兩種手段分別檢測PTEN Degron對皮質(zhì)神經(jīng)元m TOR通路的激活情況;免疫熒光法檢測PTEN Degron注射后對皮質(zhì)存在的可能炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)細胞刺激;使用兩種顏色示蹤劑,順行示蹤CST以檢驗PTEN Degron持續(xù)微量泵入對C5鉗夾傷小鼠的軸突再生促進作用;檢測PTEN Degron對SCI小鼠行為學(xué)的影響。4、利用化學(xué)遺傳法DREADDs(特異性藥物激活的特異性受體)和轉(zhuǎn)基因手段,混合攜帶重組酶Cre的腺相關(guān)病毒AAV1-Cre-GFP和AAV8-h M3Dq-m Cherry皮質(zhì)注射。Cre酶可以敲除Ptenfl/fl小鼠的Pten基因,同時在N-氧化氯氮平(CNO)的出現(xiàn)下提高神經(jīng)活動;使用免疫熒光法觀察皮質(zhì)m TOR通路的激活情況和神經(jīng)活動的提高情況;觀察CST的軸突再生情況;行為學(xué)檢測SCI小鼠運動功能的恢復(fù)。主要結(jié)果:1、C5脊髓鉗夾損傷主要引起動物上肢精細運動功能的持久障礙,相比對照組差異明顯,P0.05;該模型對動物下肢的步行活動影響較小,動物一般情況較好;皮質(zhì)脊髓束(CST)和紅核脊髓束(RST)均因損傷而斷裂,即使等到SCI后八周仍然沒有任何再生的跡象,軸突回撤(Retraction or Die back)現(xiàn)象明顯;SCI后局部再生抑制蛋白Nogo-A、MAG、CSPGs等表達明顯上調(diào),P0.05,星形膠質(zhì)和小膠質(zhì)細胞激活明顯,表達相應(yīng)蛋白增多,P0.05;SCI后皮質(zhì)和紅核神經(jīng)元m TOR活性水平明顯下降,相比sham組差異明顯,P0.05。2、成功建立皮質(zhì)神經(jīng)元體外培養(yǎng)體系并合成PTEN降解肽(Degron);PTEN Degron干預(yù)4小時神經(jīng)元PTEN蛋白便被有效的敲減,P0.05,這種現(xiàn)象持續(xù)時間長達48小時,且能被蛋白酶體抑制劑MG132阻斷;PTEN Degron能有效促進DRG神經(jīng)突起的生長,提高神經(jīng)元p-S6表達水平,P0.05,MG132或雷帕霉素能阻斷PTEN Degron的作用;在CSPGs抑制性微環(huán)境中,PTEN Degron同樣能促進DRG生長,P0.05。3、PTEN Degron皮質(zhì)注射后4小時便引起皮質(zhì)神經(jīng)元p-S6表達增加,這種現(xiàn)象持續(xù)在注射后3天消失;PTEN Degron注射引起一過性的皮質(zhì)Iba-1膠質(zhì)激活和Neu N表達下調(diào);PTEN Degron 30μg/d的持續(xù)微量泵泵入同樣能激活皮質(zhì)神經(jīng)元m TOR活性;PTEN Dgron泵入能促進泵入側(cè)CST的出芽再生,緩解軸突回撤,P0.05;PTEN Degron對病灶遠端的軸突再生沒有明顯的促進作用,P0.05;PTEN Degron對SCI小鼠的上肢精細運動功能恢復(fù)沒有明顯促進作用,P0.05。4、單獨敲除Pten或提高神經(jīng)活動對CST軸突再生都有促進作用,若將二者聯(lián)合應(yīng)用,對SCI后軸突再生的刺激作用更強,P0.05;聯(lián)合m TOR和刺激神經(jīng)活動有利于動物上肢精細運動功能的恢復(fù),P0.05。主要結(jié)論:1、C5脊髓鉗夾與臨床相關(guān)性密切,適合作為軸突再生的研究模型,且可以進行與CST再生相關(guān)的隨意運動功能檢測。SCI不僅引起局部抑制性微環(huán)境的形成,還導(dǎo)致神經(jīng)元軸突內(nèi)源性再生能力下降。2、PTEN Degron能快速敲減培養(yǎng)神經(jīng)元PTEN蛋白,激活m TOR通路,促進DRG突起的生長。PTEN Degron發(fā)揮作用的機制和蛋白酶體功能及m TOR通路有關(guān)。3、PTEN Degron體內(nèi)應(yīng)用同樣能快速激活m TOR通路,發(fā)揮有限的促進軸突出芽再生的作用。PTEN Degron側(cè)腦室泵入兩周不足以促進SCI小鼠運動功能的恢復(fù)。4、聯(lián)合調(diào)控m TOR和神經(jīng)活動對SCI后軸突再生具有明顯的促進作用,改善動物上肢精細運動功能的恢復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R651.2

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