本文關(guān)鍵詞：調(diào)控mTOR信號(hào)通路和神經(jīng)活動(dòng)促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 調(diào)控 mTOR 信號(hào) 通路 神經(jīng) 活動(dòng) 促進(jìn) 脊髓 損傷 后軸 突再 生的 實(shí)驗(yàn) 研究

【摘要】：作為全球青壯年人群重要的致殘?jiān)?脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)一直以來(lái)都是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn),也是亟待有效治療手段的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerves system,CNS)損傷性疾病之一。從脊髓損傷的病理機(jī)制來(lái)講,損傷造成的神經(jīng)傳導(dǎo)束斷裂-軸突(axon)斷裂,大腦與脊髓失去信息聯(lián)系無(wú)疑是導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能障礙的主要原因之一。因此,如何促進(jìn)受損神經(jīng)纖維的軸突再生(axon regeneration),恢復(fù)腦-脊髓之間的信息聯(lián)系是治療脊髓損傷的重要突破口。研究表明,軸突再生主要受到以下兩方面因素的影響:(1)損傷局部的抑制性微環(huán)境,如髓鞘相關(guān)抑制因子(Myelin-associated inhibitors,MAIs),硫酸軟骨素蛋白多糖(Chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs),膠質(zhì)瘢痕(glia scar)等。(2)減弱的成體神經(jīng)元內(nèi)在再生能力。通過(guò)調(diào)控外源性抑制因素,比如敲除Nogo、促進(jìn)CSPGs的降解等方式,發(fā)現(xiàn)脊髓損傷動(dòng)物的再生能力有所增加、軸突可塑性增強(qiáng),部分研究甚至觀察到小鼠具有更好的行為學(xué)表現(xiàn)。但是,在這些針對(duì)局部抑制因素的調(diào)控措施中,很少觀察到長(zhǎng)距離(1 mm)的軸突再生。而且,調(diào)控外源性因素對(duì)控制隨意運(yùn)動(dòng)最重要的傳導(dǎo)束-皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tract,CST)的再生影響有限。另外,增強(qiáng)的神經(jīng)可塑性和出芽再生也能夠在一定的康復(fù)訓(xùn)練策略中獲得。以上研究提示,提高中樞神經(jīng)元的內(nèi)源性再生能力可能更為重要。研究發(fā)現(xiàn),敲除Pten(phosphatase and tensin homolog,磷酸酶及張力蛋白同源物)基因能夠提高神經(jīng)元的的內(nèi)源性軸突再生能力。Pten是一種腫瘤抑制基因,具有脂質(zhì)和蛋白磷酸酶兩種活性,對(duì)PI3K/AKT/m TOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白,m TOR)具有負(fù)調(diào)控作用。m TOR通路的激活幾乎都能夠改變目前所有已知的細(xì)胞代謝狀況,促進(jìn)生長(zhǎng)所必須的結(jié)構(gòu)單位和大分子物質(zhì)的合成,在接受細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)刺激和調(diào)控細(xì)胞代謝狀態(tài)過(guò)程中起了核心控制作用。m TOR不僅可以被營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子或特定的細(xì)胞環(huán)境所激活,其活性也隨著CNS的發(fā)育(視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、皮質(zhì)神經(jīng)元)完成而下調(diào)。條件性敲除視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell,RGC)的Pten基因可以促進(jìn)鉗夾損傷的視神經(jīng)軸突出現(xiàn)明顯的再生反應(yīng)。激活的m TOR信號(hào)通路還有效的減少了由損傷引起的RGC細(xì)胞死亡。同樣,在脊髓損傷模型中也發(fā)現(xiàn)條件性敲除皮質(zhì)神經(jīng)元的Pten基因能夠促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tract,CST)的軸突再生,隨后,該方法被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室重復(fù)并且證實(shí)有效,成為調(diào)控再生內(nèi)源性因素的核心分子通路。但是在以往這些針對(duì)PTEN和m TOR的再生研究中,學(xué)者們大多采用轉(zhuǎn)基因小鼠(將目的基因插入Lox P位點(diǎn)之間,以實(shí)現(xiàn)條件性敲除)作為研究對(duì)象;由于起始表達(dá)時(shí)間較慢,攜帶Cre同源重組酶的腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)也需要在損傷之前數(shù)周(一般四周,甚至更長(zhǎng)時(shí)間)注射到感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)。RNA干擾(RNAi)作為有效沉默或抑制目標(biāo)基因表達(dá)的方式已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中。但是,在活體研究中,Sh RNA和Si RNA都需要鉚定于相應(yīng)的病毒載體上。而目前感染非分裂細(xì)胞(皮質(zhì)神經(jīng)元)的慢病毒和腺相關(guān)病毒存在持續(xù)表達(dá)、基因組整合等不確定的風(fēng)險(xiǎn),加之Pten持續(xù)敲除增加了發(fā)生腫瘤、癲癇等風(fēng)險(xiǎn)。這些問(wèn)題的存在限制了調(diào)控內(nèi)源性再生能力以促進(jìn)軸突再生、治療脊髓損傷的臨床轉(zhuǎn)化可能。基于HIV-1的Tat的蛋白降解肽-Degron是一種能夠有效、快速、可逆的誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白降解,實(shí)現(xiàn)蛋白水平調(diào)節(jié)的干預(yù)方式。該肽段包含三個(gè)部分:Tat結(jié)構(gòu)域,負(fù)責(zé)穿膜;蛋白結(jié)合域,負(fù)責(zé)與目標(biāo)蛋白結(jié)合;降解誘導(dǎo)序列。研究顯示,利用該方法敲減(death associated protein kinase 1,DAPK1)并誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用。而且,最近一項(xiàng)利用該方法NA-1降解肽的研究(目標(biāo)蛋白為PSD95,敲減后有神經(jīng)保護(hù)作用)在92例腦卒中患者中做了II期的臨床試驗(yàn),初步證明本方法安全有效。因此,該方法有望成為調(diào)控體內(nèi)靶標(biāo)蛋白表達(dá)的重要備選方式,逐漸受到關(guān)注。本研究中,我們?cè)O(shè)計(jì)了特異性的針對(duì)PTEN的降解肽,并在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和脊髓損傷模型中驗(yàn)證了該Degron對(duì)軸突再生的促進(jìn)作用。最后我們將探討在敲除Pten激活m TOR信號(hào)通路的基礎(chǔ)上利用化學(xué)遺傳學(xué)方法提高神經(jīng)活動(dòng)對(duì)脊髓損傷小鼠軸突再生的促進(jìn)作用和功能恢復(fù)作用。主要方法:1、利用自行設(shè)計(jì)的鉗夾鉗制備小鼠頸5(C5)脊髓鉗夾損傷模型;使用圓筒試驗(yàn)、水平樓梯、梳理測(cè)試、廂式食物抓取試驗(yàn)、BMS評(píng)分等方式評(píng)價(jià)C5脊髓鉗夾傷模型小鼠的行為學(xué)特點(diǎn);利用免疫熒光法檢測(cè)脊髓損傷局部GFAP、CSPGs、Iba-1、MAG、Nogo-A等抑制性蛋白和膠質(zhì)激活情況;使用順行示蹤法評(píng)價(jià)控制隨意運(yùn)動(dòng)的皮質(zhì)脊髓束、紅核脊髓束在損傷后的情況;使用逆行示蹤法分析SCI后皮質(zhì)神經(jīng)元和紅核神經(jīng)元m TOR通路的活性。2、根據(jù)文獻(xiàn),設(shè)計(jì)、合成針對(duì)PTEN蛋白的Degron;建立體外培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRG)并驗(yàn)證;使用WB檢測(cè)PTEN Degron對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元PTEN蛋白的敲減情況;使用免疫熒光檢測(cè)PTEN Degron對(duì)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)情況和m TOR通路的激活情況;制備人工CSPGs抑制性微環(huán)境,檢測(cè)PTEN Degron對(duì)DRG生長(zhǎng)的刺激作用。3、利用皮質(zhì)局部注射和微量泵持續(xù)泵入兩種手段分別檢測(cè)PTEN Degron對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元m TOR通路的激活情況;免疫熒光法檢測(cè)PTEN Degron注射后對(duì)皮質(zhì)存在的可能炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)細(xì)胞刺激;使用兩種顏色示蹤劑,順行示蹤C(jī)ST以檢驗(yàn)PTEN Degron持續(xù)微量泵入對(duì)C5鉗夾傷小鼠的軸突再生促進(jìn)作用;檢測(cè)PTEN Degron對(duì)SCI小鼠行為學(xué)的影響。4、利用化學(xué)遺傳法DREADDs(特異性藥物激活的特異性受體)和轉(zhuǎn)基因手段,混合攜帶重組酶Cre的腺相關(guān)病毒AAV1-Cre-GFP和AAV8-h M3Dq-m Cherry皮質(zhì)注射。Cre酶可以敲除Ptenfl/fl小鼠的Pten基因,同時(shí)在N-氧化氯氮平(CNO)的出現(xiàn)下提高神經(jīng)活動(dòng);使用免疫熒光法觀察皮質(zhì)m TOR通路的激活情況和神經(jīng)活動(dòng)的提高情況;觀察CST的軸突再生情況;行為學(xué)檢測(cè)SCI小鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。主要結(jié)果:1、C5脊髓鉗夾損傷主要引起動(dòng)物上肢精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能的持久障礙,相比對(duì)照組差異明顯,P0.05;該模型對(duì)動(dòng)物下肢的步行活動(dòng)影響較小,動(dòng)物一般情況較好;皮質(zhì)脊髓束(CST)和紅核脊髓束(RST)均因損傷而斷裂,即使等到SCI后八周仍然沒(méi)有任何再生的跡象,軸突回撤(Retraction or Die back)現(xiàn)象明顯;SCI后局部再生抑制蛋白Nogo-A、MAG、CSPGs等表達(dá)明顯上調(diào),P0.05,星形膠質(zhì)和小膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯,表達(dá)相應(yīng)蛋白增多,P0.05;SCI后皮質(zhì)和紅核神經(jīng)元m TOR活性水平明顯下降,相比sham組差異明顯,P0.05。2、成功建立皮質(zhì)神經(jīng)元體外培養(yǎng)體系并合成PTEN降解肽(Degron);PTEN Degron干預(yù)4小時(shí)神經(jīng)元PTEN蛋白便被有效的敲減,P0.05,這種現(xiàn)象持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)48小時(shí),且能被蛋白酶體抑制劑MG132阻斷;PTEN Degron能有效促進(jìn)DRG神經(jīng)突起的生長(zhǎng),提高神經(jīng)元p-S6表達(dá)水平,P0.05,MG132或雷帕霉素能阻斷PTEN Degron的作用;在CSPGs抑制性微環(huán)境中,PTEN Degron同樣能促進(jìn)DRG生長(zhǎng),P0.05。3、PTEN Degron皮質(zhì)注射后4小時(shí)便引起皮質(zhì)神經(jīng)元p-S6表達(dá)增加,這種現(xiàn)象持續(xù)在注射后3天消失;PTEN Degron注射引起一過(guò)性的皮質(zhì)Iba-1膠質(zhì)激活和Neu N表達(dá)下調(diào);PTEN Degron 30μg/d的持續(xù)微量泵泵入同樣能激活皮質(zhì)神經(jīng)元m TOR活性;PTEN Dgron泵入能促進(jìn)泵入側(cè)CST的出芽再生,緩解軸突回撤,P0.05;PTEN Degron對(duì)病灶遠(yuǎn)端的軸突再生沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用,P0.05;PTEN Degron對(duì)SCI小鼠的上肢精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)沒(méi)有明顯促進(jìn)作用,P0.05。4、單獨(dú)敲除Pten或提高神經(jīng)活動(dòng)對(duì)CST軸突再生都有促進(jìn)作用,若將二者聯(lián)合應(yīng)用,對(duì)SCI后軸突再生的刺激作用更強(qiáng),P0.05;聯(lián)合m TOR和刺激神經(jīng)活動(dòng)有利于動(dòng)物上肢精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù),P0.05。主要結(jié)論:1、C5脊髓鉗夾與臨床相關(guān)性密切,適合作為軸突再生的研究模型,且可以進(jìn)行與CST再生相關(guān)的隨意運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)。SCI不僅引起局部抑制性微環(huán)境的形成,還導(dǎo)致神經(jīng)元軸突內(nèi)源性再生能力下降。2、PTEN Degron能快速敲減培養(yǎng)神經(jīng)元PTEN蛋白,激活m TOR通路,促進(jìn)DRG突起的生長(zhǎng)。PTEN Degron發(fā)揮作用的機(jī)制和蛋白酶體功能及m TOR通路有關(guān)。3、PTEN Degron體內(nèi)應(yīng)用同樣能快速激活m TOR通路,發(fā)揮有限的促進(jìn)軸突出芽再生的作用。PTEN Degron側(cè)腦室泵入兩周不足以促進(jìn)SCI小鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。4、聯(lián)合調(diào)控m TOR和神經(jīng)活動(dòng)對(duì)SCI后軸突再生具有明顯的促進(jìn)作用,改善動(dòng)物上肢精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R651.2

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 ;切斷家兔外周面神經(jīng)的軸突再生:軸突再生數(shù)目與行為和誘發(fā)面阻活動(dòng)的關(guān)系[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(耳鼻咽喉科學(xué)分冊(cè));1999年03期

2 胡建國(guó),陸佩華,徐曉明;中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生抑制蛋白[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2004年04期

3 張宏志;馮世慶;;抗神經(jīng)再生抑制因子促進(jìn)軸突再生的研究進(jìn)展[J];中國(guó)脊柱脊髓雜志;2008年02期

4 王養(yǎng)華;許衛(wèi)紅;;髓鞘相關(guān)抑制因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生中的作用[J];醫(yī)學(xué)綜述;2012年09期

5 徐浩梁;中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生的幾個(gè)問(wèn)題[J];中國(guó)脊柱脊髓雜志;1991年02期

6 梁克玉;電場(chǎng)與脊髓軸突再生[J];臨床外科雜志;1995年05期

7 景筠,Nina Irwin,Larry I.Benowitz;肌苷調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞軸突再生[J];眼科研究;2000年03期

8 梁克玉;;非甾體抗炎藥尼美舒利的新用途——促進(jìn)脊髓軸突再生[J];中醫(yī)正骨;2009年01期

9 武麗;張麗萍;張曼;夏猛;;中樞神經(jīng)軸突再生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究進(jìn)展[J];時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥;2012年02期

10 楊哲;;促使中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)情報(bào);1985年22期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 沈慧勇;吳燕峰;唐勇;陳燕濤;程志安;;低溫保存嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞移植對(duì)脊髓軸突再生的影響[A];第八屆全國(guó)骨科新進(jìn)展、新技術(shù)學(xué)習(xí)班講義匯編[C];2005年

2 鄧宇斌;吳洪福;;水凝膠遞送Lingo-1 RNAi對(duì)脊髓損傷神經(jīng)軸突再生的作用及機(jī)制研究[A];中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)第十三屆腫瘤、第十四屆免疫專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2012年

3 丁月彤;馮佳;吳武田;周立兵;;皮質(zhì)脊髓束遺傳缺失小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突再生和功能恢復(fù)[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2013年年會(huì)論文文摘匯編[C];2013年

4 張棟棟;;Rho抑制劑促進(jìn)脊髓損傷小鼠脊髓軸突再生的研究[A];第七屆全國(guó)創(chuàng)傷學(xué)術(shù)會(huì)議暨2009海峽兩岸創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)論壇論文匯編[C];2009年

5 毛倫林;程堅(jiān);管陽(yáng)太;;PTEN抑制劑bpv對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠軸突再生和功能康復(fù)的影響[A];2012中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師分會(huì)神經(jīng)病學(xué)專家委員會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2012年

6 林森;梁亞杰;郭強(qiáng);周紅利;張吉強(qiáng);邊晨;文燦;張艷玲;熊鷹;李淑蓉;蘇炳銀;;TRIF調(diào)控視神經(jīng)再生及機(jī)制[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2011年年會(huì)論文文摘匯編[C];2011年

7 周松林;于彬;王勇軍;顧曉松;丁斐;;miR-21在坐骨神經(jīng)軸突再生修復(fù)中的作用機(jī)制[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2011年年會(huì)論文文摘匯編[C];2011年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 記者 張曄　王燕寧;治愈癱瘓不再是夢(mèng)想[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

2 本報(bào)記者 殷俊;南醫(yī)大神經(jīng)再生機(jī)制研究獲重大突破[N];江蘇科技報(bào);2008年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 郭佳;Fibulin-5對(duì)MCAO/再灌注大鼠血腦屏障和軸突再生的影響及機(jī)制探討[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

2 周恒星;慢病毒載體介導(dǎo)siRNA沉默PTPσ基因促進(jìn)大腦皮層神經(jīng)元軸突再生及脊髓損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2014年

3 張文明;胚胎脊髓細(xì)胞“寄養(yǎng)”遠(yuǎn)端神經(jīng)促進(jìn)延期神經(jīng)修復(fù)后軸突再生[D];福建醫(yī)科大學(xué);2016年

4 高璇;人參皂苷Rb1促進(jìn)局灶性腦梗死小鼠軸突再生及其機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2017年

5 譚波濤;調(diào)控mTOR信號(hào)通路和神經(jīng)活動(dòng)促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

6 殷成;載脂蛋白E與神經(jīng)元損傷和軸突再生相關(guān)機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

7 田曦亮;基于微流控技術(shù)平臺(tái)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分選、誘導(dǎo)并促進(jìn)軸突再生的實(shí)驗(yàn)研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2013年

8 向強(qiáng);E3B1基因的表達(dá)調(diào)控與軸突再生的相關(guān)性研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

9 張伯寅;GSK3信號(hào)分子在神經(jīng)細(xì)胞軸突再生中作用的研究[D];吉林大學(xué);2014年

10 李軍;周圍神經(jīng)損傷后雪旺細(xì)胞與軸突再生關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2008年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張文彬;加味黃芪桂枝五物湯在胸腰段脊髓損傷中的應(yīng)用及機(jī)制研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

2 原文琦;坐骨神經(jīng)預(yù)損傷通過(guò)miR-17-5p/STAT3/GAP-43通路促進(jìn)初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元軸突再生的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

3 唐曉軍;脊神經(jīng)后根吻合軸突再生重建感覺(jué)傳入通路的實(shí)驗(yàn)研究[D];南華大學(xué);2010年

4 劉志峰;臂叢損傷后遠(yuǎn)側(cè)段神經(jīng)慢性變性對(duì)軸突再生及肌肉功能恢復(fù)的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年

5 吳韜韜;ROCK Ⅱ特異抑制性小分子多肽促進(jìn)大鼠脊髓損傷后軸突再生與神經(jīng)功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2012年

6 屈一鳴;ROCKII特異抑制性小分子多肽促進(jìn)新生大鼠DRGN_s軸突再生的體外實(shí)驗(yàn)研究[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2011年

7 范紅石;夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動(dòng)術(shù)對(duì)兔坐骨神經(jīng)損傷后軸突再生及血清P50、P65的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2015年

8 朱宗波;Rho/ROCKⅡ特異抑制性小分子多肽與TDZD-8促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2012年

9 黃貽澤;聯(lián)合應(yīng)用Rho-ROCKⅡ及GSK-3β抑制劑促進(jìn)新生大鼠DRGNs軸突再生的體外實(shí)驗(yàn)研究[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2009年

10 王敬;腺病毒介導(dǎo)的RNAi對(duì)缺血再灌注大鼠腦內(nèi)NgR表達(dá)、軸突再生和神經(jīng)行為的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

，

本文編號(hào)：1277531