本文關(guān)鍵詞：骨髓調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腦梗死中的變化及作用研究

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【摘要】：背景腦梗死不僅會(huì)造成神經(jīng)元的死亡,還會(huì)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生顯著改變。免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱決定了腦梗死的發(fā)展及預(yù)后走向。骨髓是構(gòu)成免疫系統(tǒng)的重要成分之一,是最為重要的中樞免疫器官,主要通過生成及釋放免疫細(xì)胞的方式調(diào)控外周免疫反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T(regulatory T,Treg)細(xì)胞是一群以表達(dá)Fox P3基因?yàn)樘卣鞯腡淋巴細(xì)胞,為骨髓執(zhí)行免疫功能的核心成分之一,占骨髓CD4+淋巴細(xì)胞的1/3以上,通過控制效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量與分泌功能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。由于骨髓Treg細(xì)胞的占有比例和細(xì)胞的免疫抑制力均顯著高于循環(huán)、脾臟和胸腺的Treg細(xì)胞,無論是其數(shù)量還是功能變化都將對(duì)免疫相關(guān)疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗移植物宿主病等產(chǎn)生重要的影響。骨髓Treg細(xì)胞已成為治療免疫相關(guān)疾病的重要靶點(diǎn)。然而,骨髓Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能在腦梗死后發(fā)生何種變化以及這種變化具有何種作用尚不清楚。骨髓細(xì)胞的生物學(xué)行為受大腦發(fā)出的交感神經(jīng)纖維(SNS)調(diào)控。腦炎可活化SNS并通過骨髓內(nèi)的β-腎上腺素受體(β-AR)促進(jìn)前列腺素E2(PGE2)的分泌。而PGE2是促進(jìn)CD4+CD25-細(xì)胞轉(zhuǎn)為Treg細(xì)胞的關(guān)鍵因子,前列腺素受體-4(EP4)是該過程的主要受體。PGE2-EP4通路下游的主要效應(yīng)分子是核因子κB受體活化因子配體(RANKL),因?yàn)镽ANKL直接作用于CD11C+樹突狀細(xì)胞(DCs)的核因子κB受體活化因子(RANK),通過增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的分泌后誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的形成。RANKL促使Treg細(xì)胞擴(kuò)增的作用已被廣泛證實(shí)。系列研究表明,骨髓CD4+細(xì)胞高表達(dá)EP4且有分泌RANKL的能力,DCs圍繞CD4+分布。基于前述研究,我們猜想:腦梗死可能會(huì)活化SNS并通過β-AR加強(qiáng)PGE2/EP4-RANKL信號(hào),增加Treg細(xì)胞的數(shù)量并加強(qiáng)其免疫抑制功能。遷移是Treg細(xì)胞執(zhí)行免疫功能的先決條件。在生理狀態(tài)下,骨髓Treg細(xì)胞的濃度顯著高于外周,主要是由于Treg表達(dá)的CXCR4與骨髓基質(zhì)表達(dá)的SDF-1結(jié)合后被滯留于骨髓腔所致。關(guān)于SNS調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞的研究提示,骨髓交感神經(jīng)纖維末梢在不間斷釋放去甲腎上腺素(NE)。當(dāng)骨髓內(nèi)的NE達(dá)到生物學(xué)濃度時(shí),β3-AR信號(hào)被活化并將SDF-1降解,引起CXCR4+細(xì)胞遷移出骨髓。因此,我們?cè)O(shè)想腦梗死活化的SNS是否會(huì)通過β3-AR信號(hào)通路促使CXCR4+Treg細(xì)胞從骨髓遷移至與外周。腦梗死最為重要的并發(fā)癥是肺部感染,是腦梗死后期最為重要的死因。腦梗死相關(guān)免疫抑制被認(rèn)為是肺部感染的重要原因,具體表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的功能失活和數(shù)量下降,抗感染因子干擾素γ顯著減少等。如前所述,Treg細(xì)胞具有肯定的免疫抑制功能,但骨髓Treg細(xì)胞是否參與腦梗死相關(guān)免疫抑制過程尚不清楚。目的研究骨髓Treg細(xì)胞在腦梗死后的數(shù)量、功能變化以及涉及到的相關(guān)分子機(jī)制,并探討這種變化的臨床作用。方法1.將雄性C57BL/6小鼠分為假手術(shù)組,溶劑處理組和藥物處理組;采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞模型。2.采用Western blot觀察骨髓SNS活化標(biāo)志物酪氨酸羥化酶(TH)、PGE2合成限速酶COX-2以及SDF-1的變化,同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓Treg細(xì)胞的數(shù)量改變;然后使用6-OHDA毀損SNS后再觀察前述指標(biāo)的變化,評(píng)價(jià)SNS信號(hào)是否涉及到骨髓Treg細(xì)胞數(shù)量、COX-2和SDF-1表達(dá)的變化。3.利用特異性阻斷劑分別阻斷β2-AR、β3-AR信號(hào)后,研究何種受體在Treg細(xì)胞數(shù)量、COX-2、SDF-1變化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。4.阻斷COX2/PGE2、EP4、RANKL信號(hào),觀察Treg細(xì)胞數(shù)量變化,論證COX2/PGE2、EP4、RANKL與Treg數(shù)量變化的因果關(guān)系。5.分離出Treg細(xì)胞,通過共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和Q-PCR對(duì)比研究不同來源的骨髓Treg細(xì)胞免疫抑制力、遷移能力和Fox P3表達(dá)的差異。最后阻斷引起骨髓Treg細(xì)胞變化的關(guān)鍵通路,觀察外周Treg細(xì)胞數(shù)量和肺部感染程度的變化,明確骨髓Treg細(xì)胞與腦梗死相關(guān)免疫抑制的關(guān)系。6.數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.腦梗死快速激活骨髓的SNS(TH于MCAO術(shù)后6h顯著增高),并增加Treg細(xì)胞的數(shù)量、上調(diào)COX-2的表達(dá),抑制SDF-1的分泌(P0.05);使用6-OHDA毀損SNS能阻止腦梗死對(duì)骨髓Treg細(xì)胞及分子成分的改變(P0.05)。2.采用布托沙明阻斷β2-AR信號(hào)將抑制骨髓Treg細(xì)胞、COX-2的增加(P0.05),但是對(duì)SDF-1無影響(P0.05);采用SR59230A阻斷β3-AR信號(hào)抑制了SDF-1的減少(P0.05),但是卻對(duì)COX-2的表達(dá)無影響(P0.05),說明β2-AR信號(hào)在腦梗死后骨髓的擴(kuò)增和COX-2的上調(diào)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,而β3-AR信號(hào)可能涉及到骨髓Treg細(xì)胞的遷移。3.采用吲哚美辛抑制COX-2的酶活性或利用L-161,982封閉EP4信號(hào)能顯著減少腦梗死后骨髓Treg細(xì)胞數(shù)目、RANKL的表達(dá)(P0.05),說明PGE2-EP4信號(hào)在促進(jìn)Treg細(xì)胞的擴(kuò)增和RANKL的表達(dá)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用;采用OPG封閉RNAKL信號(hào)也能減少腦梗死后骨髓Treg細(xì)胞的數(shù)量(P0.05),說明PGE2-EP4信號(hào)通過上調(diào)RANKL的表達(dá)促進(jìn)骨髓Treg細(xì)胞的擴(kuò)增。4.體外實(shí)驗(yàn)顯示,正常小鼠骨髓Treg細(xì)胞(Nor BM-Treg)對(duì)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞(Teff)的抑制力及Fox P3的表達(dá)水平均明顯高于脾臟Treg細(xì)胞(Nor Sp-Treg)(P0.05),腦梗死(7d)小鼠骨髓Treg細(xì)胞(Isc BM-Treg)的免疫抑制力及Fox P3的表達(dá)水平均明顯高于前述兩者(P0.05);然而,取自注射了OPG(封閉RNAKL)的腦梗死小鼠骨髓Treg細(xì)胞(Isc BM-OPG-Treg)的免疫抑制力和Fox P3表達(dá)水平明顯低于Isc BM-Treg細(xì)胞(P0.05),接近Nor BM-Treg細(xì)胞的水平(P0.05),但遷移能力與Isc BM-Treg相近(P0.05),這說明RANKL信號(hào)介導(dǎo)了腦梗死后骨髓Treg細(xì)胞免疫抑制功能的增加,SNS通過其他通路增強(qiáng)了骨髓Treg細(xì)胞的遷移能力。此外,采用OPG抑制骨髓Treg細(xì)胞的擴(kuò)增或阻斷Treg細(xì)胞的外遷均能顯著減少腦梗死小鼠的肺部菌落數(shù)(MCAO術(shù)后7d)。結(jié)論1.腦梗死活化的SNS通過β2-AR信號(hào)促進(jìn)骨髓Treg細(xì)胞數(shù)量增的加及免疫抑制力的加強(qiáng)。2.SNS擴(kuò)增的骨髓Treg細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)。3.腦梗死活化的SNS通過β3-A信號(hào)促使骨髓Treg細(xì)胞遷移至外周,參與了腦梗死后期相關(guān)免疫抑制過程,促進(jìn)了肺部感染。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743.33

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本文編號(hào)：1276390