本文關(guān)鍵詞：HIF-1α通過N1ICD誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞特性

  更多相關(guān)文章： HIF-1α 慢病毒載體 肺腺癌 增殖 凋亡 N1ICD 慢病毒載體 肺腺癌 增殖 凋亡 HIF-1α N1ICD 肺腺癌 腫瘤干細(xì)胞 耐藥 自我更新

【摘要】：第1章引言腫瘤內(nèi)一小部分細(xì)胞具有自我更新、多潛能分化等干細(xì)胞特性,能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞并啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生,這一部分細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(CSCs)。CSCs的起源及維持因素不是很清楚。有研究表明,缺氧和HIFs可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞獲得CSCs特性,但分子機(jī)制不明。Notch信號(hào)通路為細(xì)胞間信息傳遞的重要方式之一。有研究發(fā)現(xiàn),Notch信號(hào)通路在肺CSCs特性的誘導(dǎo)或維持中發(fā)揮重要作用,但Notch的哪些成分在其中發(fā)揮作用目前還不清楚。本研究假設(shè)缺氧通過HIF-1α增強(qiáng)Notch1信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞獲得CSCs特性。采用慢病毒載體及轉(zhuǎn)染技術(shù),構(gòu)建HIF-1α和N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株。q PCR探討缺氧對(duì)肺腺癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響以及Notch1信號(hào)通路在其中的作用。q PCR進(jìn)一步探討HIF-1α和N1ICD對(duì)肺腺癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響。運(yùn)用構(gòu)建好的HIF-1α和N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株,通過藥物敏感實(shí)驗(yàn)、成球?qū)嶒?yàn)以及體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)來探討HIF-1α/N1ICD對(duì)肺腺癌細(xì)胞CSCs特性的影響,試圖為理解NSCLC的生物學(xué)行為提供理論依據(jù)。第2章HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株構(gòu)建目的:利用慢病毒載體構(gòu)建HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株。方法:以人HIF-1α基因編碼序列為模板,設(shè)計(jì)并合成引物。PCR法擴(kuò)增HIF-1α基因,用以構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒HBLV-HIF-1α-RFP-Puro。PCR和基因測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。高純度無內(nèi)毒素抽提慢病毒重組質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒(LV-HIF-1α)。同時(shí)構(gòu)建慢病毒空載載體(LV-RFP-Puro)作為對(duì)照。采用稀釋計(jì)數(shù)法測(cè)定病毒滴度。制備好的LV-HIF-1α和LV-RFP-Puro轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。熒光顯微鏡觀察篩選效果,Western blotting進(jìn)一步驗(yàn)證。MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活力及凋亡。結(jié)果:重組慢病毒質(zhì)粒HBLV-HIF-1α-RFP-Puro經(jīng)PCR、基因測(cè)序鑒定構(gòu)建成功。經(jīng)包裝、濃縮后獲得高滴度LV-HIF-1α和LV-RFP-Puro。LV-HIF-1α和LV-RFP-Puro轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后經(jīng)藥物反復(fù)篩選,熒光顯微鏡下觀察到70-80%的細(xì)胞帶有紅色熒光。Western blotting結(jié)果顯示A549-HIF-1α組HIF-1α、N1ICD、Hes1和Hey1蛋白的表達(dá)水平明顯高于A549-RFP-Puro組。HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)論:HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)肺腺細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。第3章N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株構(gòu)建目的:利用慢病毒載體構(gòu)建N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株。方法:以人N1ICD基因編碼序列為模板,設(shè)計(jì)并合成引物。PCR擴(kuò)增N1ICD基因,用以構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒p HBLV-N1ICD-Zs Green-Puro。PCR和基因測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒(LV-N1ICD)。同時(shí)構(gòu)建慢病毒空載載體(LV-Zs Green-Puro)。采用稀釋計(jì)數(shù)法測(cè)定病毒滴度。制備好的LV-N1ICD和LV-Zs Green-Puro轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,Western blotting檢測(cè)N1ICD、Hes1、Hey1和HIF-1α的表達(dá)。MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活力及凋亡。結(jié)果:PCR及基因測(cè)序結(jié)果表明重組慢病毒質(zhì)粒p HBLV-N1ICD-Zs GreenPuro構(gòu)建成功。經(jīng)包裝、濃縮后獲得高滴度LV-N1ICD和LV-Zs Green-Puro。慢病毒載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后經(jīng)藥物反復(fù)篩選,熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)70~80%的細(xì)胞帶有綠色熒光。Western blotting結(jié)果顯示A549-N1ICD組N1ICD、Hes1、Hey1和HIF-1α的表達(dá)水平明顯高于A549-Zs Green-Puro組。N1ICD穩(wěn)定表達(dá)可促進(jìn)A549細(xì)胞增殖。結(jié)論:N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。N1ICD穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)肺腺細(xì)胞增殖。第4章HIF-1α通過N1ICD誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞特性目的:探討HIF-1α和N1ICD在缺氧誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性中的作用。方法:q PCR探討缺氧對(duì)肺腺癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Oct4、c-Myc、ABCG2、ALDH1、KLF4和Sox2表達(dá)的影響以及Notch1信號(hào)通路在其中的作用。利用構(gòu)建好的HIF-1α和N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株,q PCR探討HIF-1α和Notch1信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響。CCK-8探討HIF-1α和Notch1信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞順鉑和多西他賽敏感性的影響,計(jì)算IC50。成球?qū)嶒?yàn)探討HIF-1α和Notch1信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞自我更新能力的影響。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)探討HIF-1α和Notch1信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。結(jié)果:缺氧可誘導(dǎo)A549細(xì)胞CD133、Oct4、c-Myc、ABCG2、ALDH1和Sox2等干細(xì)胞標(biāo)志物高表達(dá),抑制Notch1信號(hào)通路后,干細(xì)胞標(biāo)志物水平明顯下降。HIF-1α和N1ICD穩(wěn)定表達(dá)均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞多重干細(xì)胞標(biāo)志物高表達(dá),抑制Notch1信號(hào)通路可明顯抑制HIF-1α誘導(dǎo)的干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。HIF-1α和N1ICD穩(wěn)定表達(dá)均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞對(duì)順鉑和多西他賽耐藥,抑制Notch1信號(hào)通路后,A549-HIF-1α細(xì)胞恢復(fù)了對(duì)順鉑和多西他賽的敏感性。A549-HIF-1α和A549-N1ICD組細(xì)胞成球數(shù)目均明顯高于對(duì)照組,抑制Notch1信號(hào)通路可明顯抑制HIF-1α誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞自我更新。A549-HIF-1α和A549-N1ICD組形成腫瘤的體積、重量均明顯大于對(duì)照組。Notch抑制劑GSI可明顯抑制A549-HIF-1α細(xì)胞裸鼠成瘤能力。結(jié)論:HIF-1α通過N1ICD誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞特性。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 崔虎山,李星云,李成福,韓京軍,池永涌;三磷酸腺苷氯化鎂對(duì)肺腺癌細(xì)胞的抗癌作用[J];延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào);2002年03期

2 楊晉平,王澤,張?zhí)K;肺腺癌5-羥色胺受體的免疫組織化學(xué)定位[J];四川解剖學(xué)雜志;2003年02期

3 吳一龍,林嘉穎,楊學(xué)寧,喬貴賓,王坤,陳剛;肺腺癌患者酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常與臨床預(yù)后[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年12期

4 張利群,陳杭薇,王四海,辛慶紅,杜玉國(guó),尤蘭華;人呼吸道合胞病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞系的研究[J];山東醫(yī)藥;2005年12期

5 黎聯(lián);梅同華;周向東;張新高;車德亞;;細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路與基質(zhì)金屬蛋白酶-26在肺腺癌表達(dá)中的關(guān)系[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年02期

6 王亞南;顧國(guó)浩;;生物芯片在肺腺癌研究和診療中的應(yīng)用進(jìn)展[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2011年02期

7 ;我國(guó)人體肺腺癌細(xì)胞系建立[J];腫瘤;1981年06期

8 季晨陽,張義R，

本文編號(hào)：1274404