本文關(guān)鍵詞：中藥復(fù)方益肺通絡(luò)顆粒有效成分的質(zhì)量與活性研究

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【摘要】：結(jié)核病是全球流行性傳染病中致人死亡的主要疾病。尤其是近些年來(lái)環(huán)境污染所致的免疫低下、HIV和乙肝感染、抗結(jié)核藥物的毒副作用、多藥耐藥、廣泛多藥耐藥等多方面因素,使結(jié)核病的發(fā)病率重新出現(xiàn)上升的趨勢(shì)。最新結(jié)核病發(fā)病機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核病在發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中都與宿主的免疫調(diào)節(jié)能力緊密相關(guān),其中有大量細(xì)胞因子參與了免疫調(diào)節(jié),細(xì)胞因子的含量變化與疾病的病損程度以及病理變化有著密切的關(guān)系,多種因子的變化可以作為疾病診斷的標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)有針對(duì)性的對(duì)這些細(xì)胞因子進(jìn)行干預(yù),為預(yù)防和治療結(jié)核病開(kāi)辟新的途徑,因此中藥結(jié)核免疫治療也越來(lái)越顯現(xiàn)其特殊的優(yōu)越性。益肺通絡(luò)顆粒由國(guó)家"十一五"和"十二五"傳染病防治國(guó)家重大科技專項(xiàng)支持,中期臨床療效顯著,但其體內(nèi)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制不明確。本課題選擇了抗結(jié)核臨床療效確切的益肺通絡(luò)顆粒作為研究對(duì)象,綜合運(yùn)用各種國(guó)際前沿免疫治療理論及先進(jìn)的技術(shù)手段,對(duì)該藥品的體內(nèi)作用機(jī)制、物質(zhì)基礎(chǔ)以及質(zhì)量控制開(kāi)展了初步研究。本課題主要研究?jī)?nèi)容包括:(1)通過(guò)所建立的小鼠免疫低下模型,評(píng)價(jià)了益肺通絡(luò)顆粒的總提取物和多糖組分的體內(nèi)藥理活性和免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制;(2)從多波長(zhǎng)指紋圖譜、主要活性化學(xué)成分的定性定量等方面闡明了益肺通絡(luò)顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ);(3)對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程進(jìn)行了研究,為益肺通絡(luò)顆粒的臨床藥物監(jiān)測(cè)和用藥安全提供科學(xué)依據(jù);(4)對(duì)君藥白芨中主要活性成分以及抗炎作用機(jī)制進(jìn)行了研究,闡述了白芨抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理。益肺通絡(luò)顆粒的藥理作用機(jī)制研究包括藥物提取組分體外藥敏實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)免疫低下模型的建立、藥物提取物小分子組分和多糖組分體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制的評(píng)價(jià)。首先通過(guò)體外藥敏試驗(yàn)來(lái)篩選益肺通絡(luò)復(fù)方中抗結(jié)核活性比較顯著的提取部位,檢測(cè)結(jié)果顯示所有提取物在可能達(dá)到的濃度范圍內(nèi)均沒(méi)有顯現(xiàn)出體外抗結(jié)核分枝桿菌的效果。然后我們根據(jù)結(jié)核病與免疫的關(guān)系以及益肺通絡(luò)復(fù)方和單方的藥理活性以及臨床相關(guān)報(bào)道,將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到益肺通絡(luò)顆粒在體內(nèi)外的免疫治療作用研究。為了明確復(fù)方中各組分的免疫調(diào)節(jié)作用,我們將復(fù)方提取物分為小分子組分和多糖組分并分別對(duì)它們?cè)隗w內(nèi)外免疫以及抗氧化活性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在體外兩部分均具有較好的自由基清除能力且巨噬細(xì)胞也均具有明顯的保護(hù)作用,對(duì)與巨噬細(xì)胞相關(guān)的免疫功能和炎癥反應(yīng)也可能有一定程度的干預(yù)和調(diào)節(jié)的作用。在體內(nèi)也首次證明了復(fù)方具有免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化的功效,表明益肺通絡(luò)顆粒是通過(guò)免疫調(diào)節(jié)來(lái)提升機(jī)體內(nèi)的免疫防御能力。藥理作用機(jī)制研究的結(jié)果為益肺通絡(luò)顆粒通過(guò)免疫調(diào)節(jié)輔助治療耐藥結(jié)核病提供了有力的依據(jù),也為進(jìn)一步提高該藥品的抗結(jié)核治療效果和大面積臨床應(yīng)用奠定了藥理基礎(chǔ)。益肺通絡(luò)顆粒的小分子有效成分物質(zhì)基礎(chǔ)研究包括指紋圖譜的建立、主要有效成分的結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。采用HPLC-DAD技術(shù)建立了益肺通絡(luò)顆粒的雙波長(zhǎng)指紋圖譜(272和300 nm),對(duì)各特征峰進(jìn)行了單方歸屬,并采用"中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)"軟件對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià),為復(fù)方制劑成分分析奠定了基礎(chǔ)。結(jié)合LC-HRMS技術(shù)共鑒別出了益肺通絡(luò)顆粒中19種化學(xué)成分,其中香豆素類、酚酚類、黃酮類、生物堿類以及蘋果酸酯類成分相對(duì)含量較高,主要來(lái)源于君藥白芨、百部、臣藥矮地茶、紫花地丁、大薊、佐藥天冬等。并以LC-MS/MS方法確定了復(fù)方中新綠原酸、巖白菜素、隱綠原酸、綠原酸、秦皮乙素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、Militarine、蒙花苷、大薊苷的含量分別為:0.121 ±0.018、0.318±0.039、0.096±0.019、0.100±0.018、0.207 ±0.031、0.085 ± 0.021、0.058 ±0.014、0.103 ±0.020、2.152 ±0.195、0.091±0.014、0.183±0.028 mg/g,為闡明該方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制提供了依據(jù)。益肺通絡(luò)顆粒的體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)研究對(duì)益肺通絡(luò)顆粒的主要成分體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)行為的探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)巖白菜素、秦皮乙素、蘆丁三種成分在大鼠體內(nèi)的半衰期T1/2比以往報(bào)道約增加了一倍。復(fù)方制劑益肺通絡(luò)顆粒的藥代特性進(jìn)一步揭示了中藥復(fù)方體系藥代研究的復(fù)雜性,為益肺通絡(luò)顆粒的臨床藥物監(jiān)測(cè)和用藥安全提供科學(xué)依據(jù)。益肺通絡(luò)顆粒的君藥評(píng)價(jià)重點(diǎn)放在前期研究較少的白芨的有效成分、抗氧化抗炎藥理作用機(jī)制的研究。三味君藥中,有關(guān)黃精和百部相關(guān)的研究比較多,藥效成分和藥理活性比較明確,而對(duì)白芨的活性方面的研究仍舊停留在對(duì)白芨多糖的研究上,再結(jié)合本研究所揭示的、復(fù)方中含量最高的成分Militarine成分來(lái)自于白芨中。在預(yù)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),白芨脂溶性成分在抗氧化抗炎效果上要明顯優(yōu)于白芨多糖,所以我們認(rèn)為可能是脂溶性成分在其中發(fā)揮了主要作用。首先對(duì)白芨中的脂溶性成分的各分組組分的總酚含量進(jìn)行了測(cè)定,各組分清除自由基能力與多酚含量成正比。繼而通過(guò)在LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞NR8383和體內(nèi)急性(ALI)炎癥反應(yīng)模型,評(píng)價(jià)了抗氧化活性最高的組分BM60抗炎功效。結(jié)果表明經(jīng)BM60給藥治療后大鼠肺泡結(jié)構(gòu)有明顯的恢復(fù),間隔水腫減輕,肺泡腔中炎性細(xì)胞的滲出減少。同時(shí)BM60還能夠一定程度地抑制ALI肺組織中NF-kB和TNF-α、IL-1β、IL-6相關(guān)炎性因子的表達(dá),進(jìn)而減輕ALI大鼠肺部的炎癥反應(yīng)。。接下來(lái)采用HPLC-ESI-HRMS技術(shù)通過(guò)比較其化學(xué)式和不飽和度以及商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品和文獻(xiàn)資料來(lái)對(duì)BM60進(jìn)行定性分析。最終鑒別出BM60中23種化合物,聯(lián)芐類化合物6個(gè),菲類化合物8個(gè),二氫菲類化合物4個(gè),聯(lián)菲類類化合物1個(gè),黃酮類類化合物1個(gè)和2-異丁基蘋果酸葡糖基氧基芐基酯3個(gè),其中聯(lián)芐、菲類化合物種類較多,相對(duì)含量較高。該方法表征了白芨BM60部分的主要成分并為新的抗氧化抗炎活性成分的開(kāi)發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。綜上所述,本課題研究基本上明確了益肺通絡(luò)顆粒的免疫作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ),通過(guò)指紋圖譜和有效成分定量技術(shù)的建立對(duì)該產(chǎn)品的質(zhì)量控制進(jìn)行了合理的完善和豐富,體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)研究從藥代動(dòng)力學(xué)的角度初步探討了其在體內(nèi)吸收、代謝的規(guī)律,并對(duì)前期研究較少的君藥白芨的抗氧化抗炎機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了初步研究。本課題對(duì)益肺通絡(luò)顆粒的作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)研究為進(jìn)一步提高該藥品的抗結(jié)核療效和更大范圍的臨床應(yīng)用提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R286.0;R285

【參考文獻(xiàn)】

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