本文關鍵詞：肝細胞癌患者血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)及其臨床意義研究

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【摘要】：第一部分血清IGFBP7基因甲基化在乙型肝炎病毒相關肝細胞癌診斷中的價值研究研究背景在中國,肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最常見的致病原因為慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染。HCC發(fā)現(xiàn)時通常已處于晚期階段,錯過了最佳的治療時機。即使在過去的幾十年中隨著肝癌診斷能力的增強、影像學檢查手段的發(fā)展以及新的治療策略的出現(xiàn),肝癌患者的生存情況及預后仍然不容樂觀,五年生存率仍然很低,預后很差。針對肝癌的這些疾病特點,早發(fā)現(xiàn)、早治療對改善患者預后至關重要,是提高生存率的關鍵。肝組織病理學檢查是診斷肝癌最可靠的方法,但其是一種侵入性的有創(chuàng)檢查,操作復雜,風險較高,不適用于肝癌的早期篩查。到目前為止,肝癌的篩選和術后隨訪主要依賴于血清腫瘤標志物和腹部影像學診斷的聯(lián)合應用。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)為目前臨床應用較多的血清標志物,具有無創(chuàng)性和可重復性等優(yōu)勢,但其靈敏性和特異性相對較低。超聲等影像學檢查手段易受到多種因素的影響,這使得在腫瘤初始階段及時、有效的診斷肝癌較為困難。因此,完善HCC的早期診斷方法,尋找更為簡易、靈敏的非侵入性生物標志物是臨床醫(yī)生亟待解決的問題。肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程受到多種因素的影響,可能與遺傳學、表觀遺傳學改變及環(huán)境因素的綜合作用有關。作為一種廣泛研究的表觀遺傳學修飾方式,DNA甲基化是調(diào)控基因表達的重要手段。到目前為止,越來越多的證據(jù)表明異常的DNA甲基化在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,特定基因的甲基化改變或可作為腫瘤早期診斷的潛在生物標志物。類似的甲基化改變也可在血清/血漿來源的循環(huán)游離DNA(cell-freeDNA,cfDNA)中檢測到。cfDNA定義為血漿/血清中發(fā)現(xiàn)的細胞外DNA,其主要來自于原發(fā)腫瘤位點、循環(huán)腫瘤細胞及遠處轉移的凋亡和壞死的腫瘤細胞。作為一種非侵入性的"液體活檢"檢測手段,cfDNA甲基化檢測可有效避免腫瘤組織活檢,用于多種腫瘤的早期診斷。cfDNA的甲基化狀態(tài)已成為HCC早期診斷最有前景的生物標志物之一。胰島素樣生長因子結合蛋白 7(insulin-like growth factor-binding protein 7,IGFBP7)在腫瘤中的作用備受關注。多個研究發(fā)現(xiàn)IGFBP7能抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡、影響腫瘤血管穩(wěn)定性,是一種典型的腫瘤生長抑制因子。IGFBP7異常甲基化已在多種腫瘤中得到證實,參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。近期研究顯示,IGFBP7在HCC中也發(fā)揮抑癌基因的作用,因此我們推測血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)或可作為HCC患者早期診斷的潛在非侵入性生物標志物。目的本研究的主要目的是探討HCC患者血清IGFBP7基因甲基化狀態(tài),研究血清IGFBP7基因甲基化在HCC診斷中的潛在價值。方法本研究共入組2011年6月～2012年7月期間在山東大學齊魯醫(yī)院就診的136例HCC患者、46例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者和35例正常對照者。HCC診斷標準參照2010年更新的美國肝病研究協(xié)會(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)發(fā)布的《肝細胞癌臨床指南》,所有入組的HCC患者均伴有慢性HBV感染。CHB診斷標準參考2009年更新的AASLD發(fā)布的《慢性乙型肝炎實踐指南》:血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽性史超過6個月,現(xiàn)血清學檢查證實HBsAg仍為陽性和(或)病毒學檢查顯示HBVDNA仍為陽性者。血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)測定。統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0(Chicago,IL,USA)軟件。兩組數(shù)值變量之間的比較采用獨立樣本的t檢驗或Mann-Whitney U檢驗。應用卡方檢驗比較各個分組之間血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)的差異,并評估HCC患者血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)與臨床病理指標之間的關系。我們應用多元logistic回歸分析篩選血清IGFBP7基因啟動子甲基化的獨立影響因素。應用受試者工作特征曲線下面積(the area under the receiver operating characteristic curve,AUC)來評估血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)與血清AFP水平的診斷效能。采用靈敏性、特異性、陽性預測值、陰性預測值來評估不同指標的診斷準確性。P值0.05定為差異有統(tǒng)計學意義。結果1、136例HCC患者組中有89例(65%)發(fā)生IGFBP7基因啟動子區(qū)異常甲基化,46例CHB患者組中有8例(17%)發(fā)生IGFBP7基因啟動子區(qū)異常甲基化,35例正常對照者中有5例(14%)發(fā)生IGFBP7基因啟動子區(qū)異常甲基化。HCC組IGFBP7基因啟動子甲基化的比率明顯高于CHB組(P0.001)和正常對照組(P0.001)。2、IGFBP7基因甲基化與患者的性別、年齡、HBeAg、吸煙史、飲酒史、腫瘤個數(shù)、腫瘤大小、組織學分級、TNM分期、CTP分級和血清AFP水平等之間無明顯相關性(P0.05),而與血管侵襲具有明顯的相關性(P = 0.010)。同時,我們應用多元logistic回歸來篩選血清IGFBP7基因啟動子甲基化的獨立影響因素,結果顯示各臨床病理指標均不是IGFBP7基因甲基化的獨立影響因素。3、我們評估了血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)對肝癌的診斷價值。當我們從CHB患者中診斷HCC時,血清IGFBP7基因啟動子甲基化的診斷靈敏性和特異性分別為65%和83%;當我們從正常人中診斷HCC時,血清IGFBP7基因啟動子甲基化的診斷靈敏性和特異性分別為65%和86%。在區(qū)分HCC與CHB患者時,血清IGFBP7基因啟動子甲基化的AUC明顯高于血清AFP水平(0.740 vs 0.618;P0.05)。4、我們比較了血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)聯(lián)合AFP與單獨應用AFP對HCC的診斷價值。當血清AFP水平低于20 ng/ml時,IGFBP7甲基化組的HCC診斷率明顯高于IGFBP7非甲基化組(P0.001)。當血清AFP水平高于20 ng/ml時,IGFBP7甲基化組的HCC診斷率同樣明顯高于IGFBP7非甲基化組(P0.001)。在本研究中,共有143例患者可依據(jù)血清AFP水平高于20 ng/ml或IGFBP7基因啟動子發(fā)生甲基化而考慮診斷為肝癌(陽性),其中有116例肝癌患者(真陽性)和27例CHB患者(假陽性)。共有39例患者可依據(jù)血清AFP水平低于20 ng/ml且IGFBP7基因啟動子未發(fā)生甲基化而考慮排除肝癌(陰性),其中有19例CHB患者(真陰性)和20例肝癌患者(假陰性)。血清AFP水平單獨診斷肝癌的靈敏性和特異性分別為57%和52%。聯(lián)合血清IGFBP7基因啟動子甲基化與AFP診斷肝癌的靈敏性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為85%、41%、81%和49%。本研究證實AFP和IGFBP7甲基化的聯(lián)合應用比單獨應用AFP具有更高的靈敏性(P0.001)和陰性預測值(P = 0.03),但在特異性(P= 0.296)和陽性預測值(P=0.525)方面沒有明顯差異。結論1、我們的研究結果首次證實HCC患者存在血清IGFBP7基因啟動子區(qū)甲基化的異常,提示檢測該指標可作為HCC診斷非侵入性的生物學標志物。2、血清IGFBP7基因甲基化在發(fā)生血管侵犯的HCC患者中更容易檢測到,提示IGFBP7基因甲基化或可用于判斷HCC的血管侵犯。第二部分血清IGFBP7基因甲基化與乙型肝炎病毒相關肝細胞癌術后不良預后的關系研究研究背景肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝臟惡性腫瘤,是慢性肝臟疾病的嚴重并發(fā)癥。HCC發(fā)病率逐年上升,是世界范圍內(nèi)癌癥相關死亡的第三大常見原因,每年有大約600,000患者死于HCC。HCC的發(fā)病機制主要包括幾個方面:原癌基因的激活、氧化應激、腫瘤抑制功能減退等。目前氧化應激與肝癌發(fā)生、發(fā)展之間的關系已經(jīng)引起了越來越多的關注。氧化應激是身體接受有害的內(nèi)源性或外源性因素刺激而發(fā)生的反應,越來越多的證據(jù)表明,氧化應激在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要的角色。氧化應激發(fā)生時,機體生成大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),超越了抗氧化劑系統(tǒng)的消除能力,體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,從而促進基因突變和表觀遺傳學改變而導致腫瘤的發(fā)生。異常的DNA甲基化是人類腫瘤發(fā)病機制中的一個常見事件,也是發(fā)揮致瘤作用的重要的表觀遺傳學機制。與致瘤作用相關的代表性的DNA甲基化改變包括:導致某些抑癌基因失活的CpG島啟動子區(qū)域高甲基化,導致基因組不穩(wěn)定性、細胞轉化和腫瘤進展的全基因組的低甲基化。目前已知有三種活躍的DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)參與基因甲基化過程的催化:DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。許多研究表明,與腫瘤相關的DNA甲基化改變或可作為肝癌早期診斷及預后判斷的指標,并可用于評估對治療的反應。惡性腫瘤可通過腫瘤細胞的凋亡和壞死釋放大量的DNA進入血液中,稱為腫瘤來源的循環(huán)游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)。不同的遺傳和表觀遺傳分析已經(jīng)證實了 cfDNA的臨床意義。鑒于其樣本獲取簡易,創(chuàng)傷較小,成本低廉,cfDNA作為腫瘤診斷的非侵入性生物標志物獲得了越來越多的關注。在腫瘤細胞中的研究發(fā)現(xiàn)的DNA突變和甲基化改變等分子機制同樣也出現(xiàn)在cfDNA中。大量的研究表明,cfDNA的甲基化是一種用于HCC早期診斷、風險評估、治療反應及預后判斷的非常有前景的生物標志物。胰島素樣生長因子結合蛋白 7(insulin-like growth factor binding protein 7,IGFBP7)的功能包括調(diào)節(jié)細胞增殖和分化,誘導細胞凋亡和細胞衰老等。前期研究顯示,IGFBP7在包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮潛在的抑癌基因的作用,其水平與患者預后密切相關。我們的研究顯示,血清IGFBP7基因啟動子區(qū)域甲基化可以作為肝細胞癌診斷的非侵入性生物標志物。然而,血清IGFBP7基因甲基化與HCC患者預后的關系尚無研究。目的本研究的主要目的是探討氧化應激、DNMTs mRNA表達與IGFBP7基因甲基化之間的關系,并評估血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)在HCC術后預后判斷中的價值。方法本研究入組2010年I月～2013年1月期間在山東大學齊魯醫(yī)院就診并接受手術切除的155例HCC患者。HCC診斷標準參照2010年更新的美國肝病研究協(xié)會(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)發(fā)布的《肝細胞癌臨床指南》,所有入組的HCC患者均伴有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染。我們應用甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)方法檢測HCC患者血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài),應用實時熒光定量多聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測DNMTs mRNA水平,應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定氧化應激狀態(tài),包括血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone,GSH)、谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione-S-transferases,GST)水平。統(tǒng)計學分析采用統(tǒng)計軟件SPSS version 16.0(Chicago,IL,USA)完成。數(shù)值變量由均數(shù)±標準差表示。分類變量由數(shù)值(百分數(shù))表示。采用獨立樣本t檢驗和Mann-whitney U檢驗比較不同甲基化狀態(tài)的HCC患者間數(shù)值變量的差異。采用卡方檢驗比較兩組間分類變量的差異。運用Kaplan-Meier法,Log-Rank檢驗進行單因素分析,研究HCC患者術后總體生存率和早期腫瘤復發(fā)的相關因素。運用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析,研究HCC患者術后總體生存率和早期腫瘤復發(fā)的獨立危險因素。P值0.05定為差異有統(tǒng)計學意義。結果1、本研究共入組155例肝癌術后患者,其中105例(67.7%)患者血清可檢測到IGFBP7基因啟動子甲基化。我們發(fā)現(xiàn)IGFBP7基因甲基化與血管侵襲、總體生存率、早期腫瘤復發(fā)密切相關,而與性別、年齡、血清甲胎蛋白水平、腫瘤數(shù)量、腫瘤大小、有無肝硬化、分化程度及TNM分期等并無顯著的相關性(P0.05)。2、我們比較了 IGFBP7甲基化組和IGFBP7非甲基化組之間各氧化損傷指標的差異。結果顯示IGFBP7甲基化組的MDA水平(P0.001)和XOD水平(P=0.014)均明顯高于IGFBP7非甲基化組,IGFBP7甲基化組的GSH水平明顯低于IGFBP7非甲基化組(P=0.009),而兩組之間的GST水平并無明顯差異(P=0.878)。3、我們比較了 IGFBP7甲基化組和IGFBP7非甲基化組之間DNMTs表達水平的差異。結果顯示IGFBP7甲基化組的DNMT1 mRNA水平(P = 0.001)和DNMT3amRNA水平(P = 0.002)均明顯高于IGFBP7非甲基化組,而IGFBP7甲基化組與IGFBP7非甲基化組之間的DNMT3b mRNA水平(P=0.386)并無明顯差異。4、將肝癌切除手術日期作為隨訪的起始時間,死亡或最終的隨訪結束日期2016年1月為隨訪終點。我們評估了肝癌術后患者血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)對患者預后的判斷價值。Kaplan-Meier曲線分析顯示,IGFBP7基因甲基化與HCC患者術后的總體生存率明顯相關(P0.001),發(fā)生IGFBP7基因甲基化的HCC患者預后更差。5、我們應用單因素分析研究影響HCC患者術后總體生存率的相關因素,發(fā)現(xiàn)腫瘤大小、血管侵襲、TNM分期、早期腫瘤復發(fā)和IGFBP7基因甲基化均與HCC患者的術后總體生存率有關。將上述指標納入多因素分析,結果顯示TNM分期(P=0.000)、早期腫瘤復發(fā)(P=0.000)和IGFBP7基因甲基化(P = 0.000)是影響HCC患者術后總體生存率的獨立危險因素。6、我們應用單因素分析研究影響HCC患者術后早期腫瘤復發(fā)的相關因素,結果表明腫瘤大小、血管侵襲、TNM分期和IGFBP7基因甲基化與HCC患者術后早期腫瘤復發(fā)相關。我們將上述指標納入多因素分析,結果顯示TNM分期(P= 0.015)和IGFBP7基因甲基化(P= 0.008)是影響HCC患者術后早期腫瘤復發(fā)的獨立危險因素。結論1、我們的結果表明IGFBP7基因啟動子甲基化與HCC患者氧化損傷水平及DNMTs表達水平明顯相關,提示氧化應激或可通過影響DNMTs表達誘導IGFBP7基因甲基化。2、IGFBP7基因啟動子甲基化與血管侵襲、總體生存率和早期腫瘤復發(fā)相關,提示檢測血清IGFBP7基因甲基化可作為HCC患者術后預后判斷的潛在非侵入性生物標志物。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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2 Manuel Schlageter;Luigi Maria Terracciano;Salvatore D'Angelo;Paolo Sorrentino;;Histopathology of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2014年43期

3 ;Science Letters:IGFBP7 plays a potential tumor suppressor role against colorectal carcinogenesis with its expression associated with DNA hypomethylation of exon 1[J];Journal of Zhejiang University Science(Life Science);2006年11期

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本文編號：1269046