發(fā)布時間：2017-12-09 04:16

  本文關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞癌患者血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)及其臨床意義研究

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【摘要】：第一部分血清IGFBP7基因甲基化在乙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌診斷中的價值研究研究背景在中國,肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最常見的致病原因?yàn)槁砸倚透窝撞《?hepatitis B virus,HBV)感染。HCC發(fā)現(xiàn)時通常已處于晚期階段,錯過了最佳的治療時機(jī)。即使在過去的幾十年中隨著肝癌診斷能力的增強(qiáng)、影像學(xué)檢查手段的發(fā)展以及新的治療策略的出現(xiàn),肝癌患者的生存情況及預(yù)后仍然不容樂觀,五年生存率仍然很低,預(yù)后很差。針對肝癌的這些疾病特點(diǎn),早發(fā)現(xiàn)、早治療對改善患者預(yù)后至關(guān)重要,是提高生存率的關(guān)鍵。肝組織病理學(xué)檢查是診斷肝癌最可靠的方法,但其是一種侵入性的有創(chuàng)檢查,操作復(fù)雜,風(fēng)險較高,不適用于肝癌的早期篩查。到目前為止,肝癌的篩選和術(shù)后隨訪主要依賴于血清腫瘤標(biāo)志物和腹部影像學(xué)診斷的聯(lián)合應(yīng)用。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)為目前臨床應(yīng)用較多的血清標(biāo)志物,具有無創(chuàng)性和可重復(fù)性等優(yōu)勢,但其靈敏性和特異性相對較低。超聲等影像學(xué)檢查手段易受到多種因素的影響,這使得在腫瘤初始階段及時、有效的診斷肝癌較為困難。因此,完善HCC的早期診斷方法,尋找更為簡易、靈敏的非侵入性生物標(biāo)志物是臨床醫(yī)生亟待解決的問題。肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程受到多種因素的影響,可能與遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)改變及環(huán)境因素的綜合作用有關(guān)。作為一種廣泛研究的表觀遺傳學(xué)修飾方式,DNA甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的重要手段。到目前為止,越來越多的證據(jù)表明異常的DNA甲基化在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,特定基因的甲基化改變或可作為腫瘤早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。類似的甲基化改變也可在血清/血漿來源的循環(huán)游離DNA(cell-freeDNA,cfDNA)中檢測到。cfDNA定義為血漿/血清中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外DNA,其主要來自于原發(fā)腫瘤位點(diǎn)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞。作為一種非侵入性的"液體活檢"檢測手段,cfDNA甲基化檢測可有效避免腫瘤組織活檢,用于多種腫瘤的早期診斷。cfDNA的甲基化狀態(tài)已成為HCC早期診斷最有前景的生物標(biāo)志物之一。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白 7(insulin-like growth factor-binding protein 7,IGFBP7)在腫瘤中的作用備受關(guān)注。多個研究發(fā)現(xiàn)IGFBP7能抑制腫瘤細(xì)胞生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響腫瘤血管穩(wěn)定性,是一種典型的腫瘤生長抑制因子。IGFBP7異常甲基化已在多種腫瘤中得到證實(shí),參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。近期研究顯示,IGFBP7在HCC中也發(fā)揮抑癌基因的作用,因此我們推測血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)或可作為HCC患者早期診斷的潛在非侵入性生物標(biāo)志物。目的本研究的主要目的是探討HCC患者血清IGFBP7基因甲基化狀態(tài),研究血清IGFBP7基因甲基化在HCC診斷中的潛在價值。方法本研究共入組2011年6月～2012年7月期間在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院就診的136例HCC患者、46例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者和35例正常對照者。HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年更新的美國肝病研究協(xié)會(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)發(fā)布的《肝細(xì)胞癌臨床指南》,所有入組的HCC患者均伴有慢性HBV感染。CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2009年更新的AASLD發(fā)布的《慢性乙型肝炎實(shí)踐指南》:血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽性史超過6個月,現(xiàn)血清學(xué)檢查證實(shí)HBsAg仍為陽性和(或)病毒學(xué)檢查顯示HBVDNA仍為陽性者。血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)測定。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0(Chicago,IL,USA)軟件。兩組數(shù)值變量之間的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)比較各個分組之間血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)的差異,并評估HCC患者血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。我們應(yīng)用多元logistic回歸分析篩選血清IGFBP7基因啟動子甲基化的獨(dú)立影響因素。應(yīng)用受試者工作特征曲線下面積(the area under the receiver operating characteristic curve,AUC)來評估血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)與血清AFP水平的診斷效能。采用靈敏性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值來評估不同指標(biāo)的診斷準(zhǔn)確性。P值0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、136例HCC患者組中有89例(65%)發(fā)生IGFBP7基因啟動子區(qū)異常甲基化,46例CHB患者組中有8例(17%)發(fā)生IGFBP7基因啟動子區(qū)異常甲基化,35例正常對照者中有5例(14%)發(fā)生IGFBP7基因啟動子區(qū)異常甲基化。HCC組IGFBP7基因啟動子甲基化的比率明顯高于CHB組(P0.001)和正常對照組(P0.001)。2、IGFBP7基因甲基化與患者的性別、年齡、HBeAg、吸煙史、飲酒史、腫瘤個數(shù)、腫瘤大小、組織學(xué)分級、TNM分期、CTP分級和血清AFP水平等之間無明顯相關(guān)性(P0.05),而與血管侵襲具有明顯的相關(guān)性(P = 0.010)。同時,我們應(yīng)用多元logistic回歸來篩選血清IGFBP7基因啟動子甲基化的獨(dú)立影響因素,結(jié)果顯示各臨床病理指標(biāo)均不是IGFBP7基因甲基化的獨(dú)立影響因素。3、我們評估了血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)對肝癌的診斷價值。當(dāng)我們從CHB患者中診斷HCC時,血清IGFBP7基因啟動子甲基化的診斷靈敏性和特異性分別為65%和83%;當(dāng)我們從正常人中診斷HCC時,血清IGFBP7基因啟動子甲基化的診斷靈敏性和特異性分別為65%和86%。在區(qū)分HCC與CHB患者時,血清IGFBP7基因啟動子甲基化的AUC明顯高于血清AFP水平(0.740 vs 0.618;P0.05)。4、我們比較了血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)聯(lián)合AFP與單獨(dú)應(yīng)用AFP對HCC的診斷價值。當(dāng)血清AFP水平低于20 ng/ml時,IGFBP7甲基化組的HCC診斷率明顯高于IGFBP7非甲基化組(P0.001)。當(dāng)血清AFP水平高于20 ng/ml時,IGFBP7甲基化組的HCC診斷率同樣明顯高于IGFBP7非甲基化組(P0.001)。在本研究中,共有143例患者可依據(jù)血清AFP水平高于20 ng/ml或IGFBP7基因啟動子發(fā)生甲基化而考慮診斷為肝癌(陽性),其中有116例肝癌患者(真陽性)和27例CHB患者(假陽性)。共有39例患者可依據(jù)血清AFP水平低于20 ng/ml且IGFBP7基因啟動子未發(fā)生甲基化而考慮排除肝癌(陰性),其中有19例CHB患者(真陰性)和20例肝癌患者(假陰性)。血清AFP水平單獨(dú)診斷肝癌的靈敏性和特異性分別為57%和52%。聯(lián)合血清IGFBP7基因啟動子甲基化與AFP診斷肝癌的靈敏性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為85%、41%、81%和49%。本研究證實(shí)AFP和IGFBP7甲基化的聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)應(yīng)用AFP具有更高的靈敏性(P0.001)和陰性預(yù)測值(P = 0.03),但在特異性(P= 0.296)和陽性預(yù)測值(P=0.525)方面沒有明顯差異。結(jié)論1、我們的研究結(jié)果首次證實(shí)HCC患者存在血清IGFBP7基因啟動子區(qū)甲基化的異常,提示檢測該指標(biāo)可作為HCC診斷非侵入性的生物學(xué)標(biāo)志物。2、血清IGFBP7基因甲基化在發(fā)生血管侵犯的HCC患者中更容易檢測到,提示IGFBP7基因甲基化或可用于判斷HCC的血管侵犯。第二部分血清IGFBP7基因甲基化與乙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌術(shù)后不良預(yù)后的關(guān)系研究研究背景肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝臟惡性腫瘤,是慢性肝臟疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥。HCC發(fā)病率逐年上升,是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第三大常見原因,每年有大約600,000患者死于HCC。HCC的發(fā)病機(jī)制主要包括幾個方面:原癌基因的激活、氧化應(yīng)激、腫瘤抑制功能減退等。目前氧化應(yīng)激與肝癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系已經(jīng)引起了越來越多的關(guān)注。氧化應(yīng)激是身體接受有害的內(nèi)源性或外源性因素刺激而發(fā)生的反應(yīng),越來越多的證據(jù)表明,氧化應(yīng)激在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要的角色。氧化應(yīng)激發(fā)生時,機(jī)體生成大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),超越了抗氧化劑系統(tǒng)的消除能力,體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,從而促進(jìn)基因突變和表觀遺傳學(xué)改變而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。異常的DNA甲基化是人類腫瘤發(fā)病機(jī)制中的一個常見事件,也是發(fā)揮致瘤作用的重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。與致瘤作用相關(guān)的代表性的DNA甲基化改變包括:導(dǎo)致某些抑癌基因失活的CpG島啟動子區(qū)域高甲基化,導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展的全基因組的低甲基化。目前已知有三種活躍的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)參與基因甲基化過程的催化:DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。許多研究表明,與腫瘤相關(guān)的DNA甲基化改變或可作為肝癌早期診斷及預(yù)后判斷的指標(biāo),并可用于評估對治療的反應(yīng)。惡性腫瘤可通過腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死釋放大量的DNA進(jìn)入血液中,稱為腫瘤來源的循環(huán)游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)。不同的遺傳和表觀遺傳分析已經(jīng)證實(shí)了 cfDNA的臨床意義。鑒于其樣本獲取簡易,創(chuàng)傷較小,成本低廉,cfDNA作為腫瘤診斷的非侵入性生物標(biāo)志物獲得了越來越多的關(guān)注。在腫瘤細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)的DNA突變和甲基化改變等分子機(jī)制同樣也出現(xiàn)在cfDNA中。大量的研究表明,cfDNA的甲基化是一種用于HCC早期診斷、風(fēng)險評估、治療反應(yīng)及預(yù)后判斷的非常有前景的生物標(biāo)志物。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白 7(insulin-like growth factor binding protein 7,IGFBP7)的功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老等。前期研究顯示,IGFBP7在包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮潛在的抑癌基因的作用,其水平與患者預(yù)后密切相關(guān)。我們的研究顯示,血清IGFBP7基因啟動子區(qū)域甲基化可以作為肝細(xì)胞癌診斷的非侵入性生物標(biāo)志物。然而,血清IGFBP7基因甲基化與HCC患者預(yù)后的關(guān)系尚無研究。目的本研究的主要目的是探討氧化應(yīng)激、DNMTs mRNA表達(dá)與IGFBP7基因甲基化之間的關(guān)系,并評估血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)在HCC術(shù)后預(yù)后判斷中的價值。方法本研究入組2010年I月～2013年1月期間在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院就診并接受手術(shù)切除的155例HCC患者。HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年更新的美國肝病研究協(xié)會(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)發(fā)布的《肝細(xì)胞癌臨床指南》,所有入組的HCC患者均伴有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染。我們應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)方法檢測HCC患者血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài),應(yīng)用實(shí)時熒光定量多聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測DNMTs mRNA水平,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定氧化應(yīng)激狀態(tài),包括血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone,GSH)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferases,GST)水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS version 16.0(Chicago,IL,USA)完成。數(shù)值變量由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。分類變量由數(shù)值(百分?jǐn)?shù))表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和Mann-whitney U檢驗(yàn)比較不同甲基化狀態(tài)的HCC患者間數(shù)值變量的差異。采用卡方檢驗(yàn)比較兩組間分類變量的差異。運(yùn)用Kaplan-Meier法,Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析,研究HCC患者術(shù)后總體生存率和早期腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)因素。運(yùn)用Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素分析,研究HCC患者術(shù)后總體生存率和早期腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素。P值0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、本研究共入組155例肝癌術(shù)后患者,其中105例(67.7%)患者血清可檢測到IGFBP7基因啟動子甲基化。我們發(fā)現(xiàn)IGFBP7基因甲基化與血管侵襲、總體生存率、早期腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān),而與性別、年齡、血清甲胎蛋白水平、腫瘤數(shù)量、腫瘤大小、有無肝硬化、分化程度及TNM分期等并無顯著的相關(guān)性(P0.05)。2、我們比較了 IGFBP7甲基化組和IGFBP7非甲基化組之間各氧化損傷指標(biāo)的差異。結(jié)果顯示IGFBP7甲基化組的MDA水平(P0.001)和XOD水平(P=0.014)均明顯高于IGFBP7非甲基化組,IGFBP7甲基化組的GSH水平明顯低于IGFBP7非甲基化組(P=0.009),而兩組之間的GST水平并無明顯差異(P=0.878)。3、我們比較了 IGFBP7甲基化組和IGFBP7非甲基化組之間DNMTs表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示IGFBP7甲基化組的DNMT1 mRNA水平(P = 0.001)和DNMT3amRNA水平(P = 0.002)均明顯高于IGFBP7非甲基化組,而IGFBP7甲基化組與IGFBP7非甲基化組之間的DNMT3b mRNA水平(P=0.386)并無明顯差異。4、將肝癌切除手術(shù)日期作為隨訪的起始時間,死亡或最終的隨訪結(jié)束日期2016年1月為隨訪終點(diǎn)。我們評估了肝癌術(shù)后患者血清IGFBP7基因啟動子甲基化狀態(tài)對患者預(yù)后的判斷價值。Kaplan-Meier曲線分析顯示,IGFBP7基因甲基化與HCC患者術(shù)后的總體生存率明顯相關(guān)(P0.001),發(fā)生IGFBP7基因甲基化的HCC患者預(yù)后更差。5、我們應(yīng)用單因素分析研究影響HCC患者術(shù)后總體生存率的相關(guān)因素,發(fā)現(xiàn)腫瘤大小、血管侵襲、TNM分期、早期腫瘤復(fù)發(fā)和IGFBP7基因甲基化均與HCC患者的術(shù)后總體生存率有關(guān)。將上述指標(biāo)納入多因素分析,結(jié)果顯示TNM分期(P=0.000)、早期腫瘤復(fù)發(fā)(P=0.000)和IGFBP7基因甲基化(P = 0.000)是影響HCC患者術(shù)后總體生存率的獨(dú)立危險因素。6、我們應(yīng)用單因素分析研究影響HCC患者術(shù)后早期腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)因素,結(jié)果表明腫瘤大小、血管侵襲、TNM分期和IGFBP7基因甲基化與HCC患者術(shù)后早期腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)。我們將上述指標(biāo)納入多因素分析,結(jié)果顯示TNM分期(P= 0.015)和IGFBP7基因甲基化(P= 0.008)是影響HCC患者術(shù)后早期腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素。結(jié)論1、我們的結(jié)果表明IGFBP7基因啟動子甲基化與HCC患者氧化損傷水平及DNMTs表達(dá)水平明顯相關(guān),提示氧化應(yīng)激或可通過影響DNMTs表達(dá)誘導(dǎo)IGFBP7基因甲基化。2、IGFBP7基因啟動子甲基化與血管侵襲、總體生存率和早期腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān),提示檢測血清IGFBP7基因甲基化可作為HCC患者術(shù)后預(yù)后判斷的潛在非侵入性生物標(biāo)志物。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1269046