HSA-IGF-1與HSA-eTGFBR2在CHO細胞中的表達及抗肝纖維化活性分析
本文關鍵詞:HSA-IGF-1與HSA-eTGFBR2在CHO細胞中的表達及抗肝纖維化活性分析
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【摘要】:胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)主要由肝臟合成和分泌,與肝功能密切相關,具有減輕肝臟氧化損傷、降低肝纖維化、改善肝功能的作用。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是已知的最強促肝纖維化因子,通過TGF-β1/Smads途徑抑制肝細胞生長、激活肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC),是一個重要的纖維化治療靶標,應用其Ⅱ型受體胞外域(extracellular transforming growth factorβreceptor II,eTGFBR2),能拮抗TGF-β1活性,發(fā)揮治療肝纖維化作用。小分子蛋白藥物(小于20 kD)在體內代謝過程中易被腎小球過濾或被蛋白酶降解,具有較短的循環(huán)半衰期,臨床使用時必須高頻或大劑量給藥才能獲得一定療效。為提高小分子蛋白穩(wěn)定性,本研究應用人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合技術,構建HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2融合蛋白并在中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary,CHO)中穩(wěn)定表達,經分離純化獲得了具生物活性的融合蛋白。對兩種融合蛋白進行體外、體內抗纖維化活性評價,探究其抑制肝纖維化進程與改善肝臟功能的作用。主要結果如下:(1)應用HSA融合技術獲得hsa-igf-1融合片段,插入真核高效表達載體pMH3中,構建重組表達載體pMH3-HSA-IGF-1并電轉染至CHO細胞中,經G418壓力篩選及單克隆挑選,獲得HSA-IGF-1穩(wěn)定表達細胞株。對表達量最高的細胞株進行3 L搖瓶補料流加培養(yǎng),經8天流加培養(yǎng),細胞密度最高達8.4×106 cells·m L-1,HSA-IGF-1的最終表達量達100 mg·L-1。經Blue柱、Octyl柱和Q柱三步純化,獲得純度約94%的HSA-IGF-1融合蛋白,整個過程總回收率約為31.5%。分離純化的HSA-IGF-1具有類似IGF-1的生物活性,通過激活PI3K/AKT信號通路,促進NIH3T3細胞增殖。(2)應用HSA融合技術獲得hsa-etgfbr2融合片段,構建重組表達載體pMH3-HSA-eTGFBR2并電轉染至CHO細胞中,經G418壓力篩選及單克隆挑選,獲得HSA-eTGFBR2穩(wěn)定表達細胞株。對表達量最高的細胞株進行3 L搖瓶流加培養(yǎng),細胞密度最高達8.5×106 cells·mL-1,HSA-eTGFBR2流加培養(yǎng)8天的最終表達量為180 mg·L-1。經Blue柱、Octyl柱和Q柱純化,獲得純度約91%的融合蛋白,總回收率約為36.8%。HSA-eTGFBR2與TGF-β1結合良好,兩者親和常數(shù)KD值為1.42×10-8 mol·L-1,HSA-eTGFBR2能拮抗TGF-β1的抑制肝細胞增殖作用。(3)對HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2進行體外抗肝纖維化活性測定。HSA-IGF-1可以解除TGF-β1對肝細胞增殖及周期的抑制作用,保護肝細胞免受TGF-β1損傷。HSA-eTGFBR2能結合TGF-β1,拮抗其促HSC細胞增殖效果。應用TGF-β1誘導的活化HSC-T6細胞作為體外肝纖維化模型,HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2能明顯降低胞內α-SMA、COLⅠ、TIMP-1及上清中COLⅠ和COLⅢ的表達水平,提高MMP-2的水平,抑制HSC-T6細胞的活化及ECM的積累。初步探討其機制,兩種融合蛋白皆能降低TGF-β1誘導的Smad3的磷酸化,從而抑制TGF-β1信號轉導,抑制TGF-β1的生物功能,發(fā)揮抗肝纖維化效果。(4)HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2的體內抗肝纖維化分析。CCl4能引起肝臟結構紊亂、肝細胞壞死、膠原纖維增生,損傷肝功能,誘導纖維化。HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2均能明顯改善肝纖維化癥狀,減輕肝細胞損傷及膠原沉積,改善肝功能,降低肝臟中纖維化標志物α-SMA和COLⅠ的表達水平,而白蛋白幾乎沒有治療效果。結果還顯示,干預治療組優(yōu)于造模后再治療組,提示肝纖維化程度較低的時候治療效果較好。HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2兩種融合蛋白均在一個低注射頻率下取得較好治療作用,顯示了兩種蛋白良好的抗肝纖維化效果。
【學位授予單位】:江南大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2017
【分類號】:R575.2
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,本文編號:1268816
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