本文關(guān)鍵詞：HSA-IGF-1與HSA-eTGFBR2在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及抗肝纖維化活性分析

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【摘要】：胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)主要由肝臟合成和分泌,與肝功能密切相關(guān),具有減輕肝臟氧化損傷、降低肝纖維化、改善肝功能的作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是已知的最強(qiáng)促肝纖維化因子,通過(guò)TGF-β1/Smads途徑抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)、激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC),是一個(gè)重要的纖維化治療靶標(biāo),應(yīng)用其Ⅱ型受體胞外域(extracellular transforming growth factorβreceptor II,eTGFBR2),能拮抗TGF-β1活性,發(fā)揮治療肝纖維化作用。小分子蛋白藥物(小于20 kD)在體內(nèi)代謝過(guò)程中易被腎小球過(guò)濾或被蛋白酶降解,具有較短的循環(huán)半衰期,臨床使用時(shí)必須高頻或大劑量給藥才能獲得一定療效。為提高小分子蛋白穩(wěn)定性,本研究應(yīng)用人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合技術(shù),構(gòu)建HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2融合蛋白并在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary,CHO)中穩(wěn)定表達(dá),經(jīng)分離純化獲得了具生物活性的融合蛋白。對(duì)兩種融合蛋白進(jìn)行體外、體內(nèi)抗纖維化活性評(píng)價(jià),探究其抑制肝纖維化進(jìn)程與改善肝臟功能的作用。主要結(jié)果如下:(1)應(yīng)用HSA融合技術(shù)獲得hsa-igf-1融合片段,插入真核高效表達(dá)載體pMH3中,構(gòu)建重組表達(dá)載體pMH3-HSA-IGF-1并電轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中,經(jīng)G418壓力篩選及單克隆挑選,獲得HSA-IGF-1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。對(duì)表達(dá)量最高的細(xì)胞株進(jìn)行3 L搖瓶補(bǔ)料流加培養(yǎng),經(jīng)8天流加培養(yǎng),細(xì)胞密度最高達(dá)8.4×106 cells·m L-1,HSA-IGF-1的最終表達(dá)量達(dá)100 mg·L-1。經(jīng)Blue柱、Octyl柱和Q柱三步純化,獲得純度約94%的HSA-IGF-1融合蛋白,整個(gè)過(guò)程總回收率約為31.5%。分離純化的HSA-IGF-1具有類似IGF-1的生物活性,通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路,促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖。(2)應(yīng)用HSA融合技術(shù)獲得hsa-etgfbr2融合片段,構(gòu)建重組表達(dá)載體pMH3-HSA-eTGFBR2并電轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中,經(jīng)G418壓力篩選及單克隆挑選,獲得HSA-eTGFBR2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。對(duì)表達(dá)量最高的細(xì)胞株進(jìn)行3 L搖瓶流加培養(yǎng),細(xì)胞密度最高達(dá)8.5×106 cells·mL-1,HSA-eTGFBR2流加培養(yǎng)8天的最終表達(dá)量為180 mg·L-1。經(jīng)Blue柱、Octyl柱和Q柱純化,獲得純度約91%的融合蛋白,總回收率約為36.8%。HSA-eTGFBR2與TGF-β1結(jié)合良好,兩者親和常數(shù)KD值為1.42×10-8 mol·L-1,HSA-eTGFBR2能拮抗TGF-β1的抑制肝細(xì)胞增殖作用。(3)對(duì)HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2進(jìn)行體外抗肝纖維化活性測(cè)定。HSA-IGF-1可以解除TGF-β1對(duì)肝細(xì)胞增殖及周期的抑制作用,保護(hù)肝細(xì)胞免受TGF-β1損傷。HSA-eTGFBR2能結(jié)合TGF-β1,拮抗其促HSC細(xì)胞增殖效果。應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)的活化HSC-T6細(xì)胞作為體外肝纖維化模型,HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2能明顯降低胞內(nèi)α-SMA、COLⅠ、TIMP-1及上清中COLⅠ和COLⅢ的表達(dá)水平,提高M(jìn)MP-2的水平,抑制HSC-T6細(xì)胞的活化及ECM的積累。初步探討其機(jī)制,兩種融合蛋白皆能降低TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3的磷酸化,從而抑制TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制TGF-β1的生物功能,發(fā)揮抗肝纖維化效果。(4)HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2的體內(nèi)抗肝纖維化分析。CCl4能引起肝臟結(jié)構(gòu)紊亂、肝細(xì)胞壞死、膠原纖維增生,損傷肝功能,誘導(dǎo)纖維化。HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2均能明顯改善肝纖維化癥狀,減輕肝細(xì)胞損傷及膠原沉積,改善肝功能,降低肝臟中纖維化標(biāo)志物α-SMA和COLⅠ的表達(dá)水平,而白蛋白幾乎沒(méi)有治療效果。結(jié)果還顯示,干預(yù)治療組優(yōu)于造模后再治療組,提示肝纖維化程度較低的時(shí)候治療效果較好。HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2兩種融合蛋白均在一個(gè)低注射頻率下取得較好治療作用,顯示了兩種蛋白良好的抗肝纖維化效果。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575.2

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