發(fā)布時(shí)間：2017-12-09 02:22

  本文關(guān)鍵詞：Cav-1與Th17、Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子在慢性阻塞性肺病中的相關(guān)性研究

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【摘要】：慢性阻塞性肺病(COPD)是一種持續(xù)進(jìn)展的以氣流受限為特征的疾病,嚴(yán)重危害人類健康,與接觸有毒顆�；驓怏w的顯著暴露引起的氣道和肺泡異常有關(guān),致殘率和死亡率極高,可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),預(yù)計(jì)2020年將成為全球第三大死亡原因。COPD是可防可治的常見病、慢性病,其急性加重和合并癥嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。因此探索COPD的發(fā)病機(jī)制可對(duì)該病的預(yù)防和治療提供依據(jù)。既往關(guān)于COPD的病情發(fā)展主要集中的氣道、肺及肺血管的炎癥反應(yīng)方面的研究。近年來(lái)研究表明,部分COPD患者即使戒煙,肺內(nèi)炎性反應(yīng)仍持續(xù)進(jìn)展,巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等在局部不斷浸潤(rùn),暗示COPD為一種慢性自身免疫性的炎癥性疾病,自身免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)紊亂參與其發(fā)病過程。中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的非特異性反應(yīng)已證實(shí)參與了COPD的發(fā)病過程,但COPD的詳細(xì)的免疫發(fā)病機(jī)制仍不清楚,很多證據(jù)表明一些免疫細(xì)胞,例如Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和炎癥細(xì)胞因子(例如Cav-1,TGF-β,IL-17、IL-10)參與COPD的發(fā)展。細(xì)菌和病毒的急性和慢性感染能加重COPD中的炎癥和激活淋巴細(xì)胞。大量的證據(jù)表明兩種CD4+T細(xì)胞亞群(即Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞)在炎癥性疾病如COPD,哮喘和特發(fā)性肺纖維化的免疫發(fā)病中起關(guān)鍵作用。Th17細(xì)胞具有促炎癥免疫反應(yīng)的作用且損害組織,Treg細(xì)胞能通過各種機(jī)制控制炎癥和免疫反應(yīng)。最近在COPD和芥子肺病中觀察到Treg和Th17細(xì)胞數(shù)量的變化及二者之間的不平衡,并且這種失衡與肺功能相關(guān)。小窩(caveolae),是細(xì)胞膜表面特化的質(zhì)膜凹陷結(jié)構(gòu),主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞基本的生理活動(dòng),包括轉(zhuǎn)胞吞作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞作用和細(xì)胞內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。小窩蛋白是小窩的結(jié)構(gòu)和功能蛋白,在人體的生理和病理過程中發(fā)揮著更顯著的作用,在人類細(xì)胞中目前已確定小窩蛋白家族中有Cav-1、Cav-2及Cav-3共3個(gè)成員,其中小窩蛋白-1(Cav-1)是小窩表面高表達(dá)且最具標(biāo)志的蛋白,且作為一個(gè)熱門話題,在肺功能障礙的肺中,尤其是呼吸道的纖維化及平滑肌功能等方面被長(zhǎng)期的研究。最近的研究發(fā)現(xiàn),Cav-1能在急性炎癥反應(yīng)中調(diào)節(jié)肺的毛細(xì)血管滲漏,在肺水腫和肺損傷中起潛在作用,同時(shí)在巨噬細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞(DC),淋巴細(xì)胞,外周血單核細(xì)胞(PBMC)和血清中可被檢測(cè)到。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在脂多糖誘導(dǎo)的氣道炎癥中,Cav-1可以通過抑制一氧化氮合酶的表達(dá)而減少NO的產(chǎn)生,進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子-k B(NF-k B)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)氣道炎癥;另有學(xué)者的研究結(jié)果顯示,Cav-1表達(dá)減少能改善多形核中性粒細(xì)胞(PMN)活化誘導(dǎo)的肺部炎癥和血管損傷。更重要的研究提示Cav-1的表達(dá)在患有哮喘或具有肺高壓的COPD患者的外周血單核細(xì)胞或血清中急劇下降。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞二者在發(fā)育過程中相互影響,并且Th17和Treg細(xì)胞之間存在重要的可塑性。這些特征表明Th17/Treg平衡在動(dòng)物模型及人類炎性疾病的發(fā)展和疾病結(jié)果中起重要作用,Treg/Th17失衡的概念在許多疾病中被廣泛的研究,包括在COPD中。因此,我們假設(shè)Cav-1可以通過調(diào)節(jié)Th17/Treg的失衡來(lái)促進(jìn)COPD的發(fā)病過程。在本研究中,我們檢測(cè)了對(duì)照組及COPD患者外周血和血漿中Cav-1、IL-17、TGF-β的表達(dá)水平以及Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞的百分比,并評(píng)估了Cav-1的表達(dá)與Treg或Th17細(xì)胞的百分比以及Th17/Treg比例之間的關(guān)系。目的Th17和Treg細(xì)胞在自身免疫疾病和慢性炎性疾病的發(fā)展中發(fā)揮著相反的作用,而Th17/Treg的平衡越來(lái)越被重視,二者失衡在慢性炎癥性疾病中具有更顯著的作用,慢性阻塞性肺病是其中之一。小窩蛋白-1已被認(rèn)為是慢性炎性呼吸道疾病的病理機(jī)制中的潛在關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。在本研究中,我們旨在檢測(cè)不同時(shí)期COPD及肺功能正常吸煙患者體內(nèi)Cav-1的水平,Treg、Th17細(xì)胞百分比的變化及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平,并評(píng)估Cav-1的表達(dá)與Treg和Th17細(xì)胞百分比以及Th17/Treg比值之間的相關(guān)性,觀察Cav-1的缺失是否參與COPD中Th17/Treg之間的平衡的調(diào)節(jié)。方法選取2014年8月份至2015年7月份于青島大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科就診的肺功能正常的吸煙者23例作為健康對(duì)照組(HC)和50例根據(jù)慢性阻塞性肺病全球倡議(GOLD指南)診斷的COPD患者。將50名COPD患者再細(xì)分為2組:根據(jù)先前描述的COPD惡化標(biāo)準(zhǔn)診斷的26名急性加重期COPD(AECOPD)患者和24名≥3個(gè)月臨床穩(wěn)定期COPD患者(SCOPD)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法(ELISA)檢測(cè)受試者外周血中的Cav-1、IL-17、TGF-β的表達(dá)水平;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組及COPD不同時(shí)期血液中Th17、Treg細(xì)胞的含量以及Th17/Treg的比值,并觀察Cav-1的改變與不同時(shí)期COPD患者血液中Th17、Treg細(xì)胞以及Th17/Treg比值變化的相關(guān)性。將血液中分離出來(lái)的PBMC培養(yǎng)24h,將PBMC轉(zhuǎn)染后48h收獲細(xì)胞,并暴露于10%香煙煙霧提取物(CSE)中24h后,通過流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)定CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞和CD4+IL-17+Th17細(xì)胞的百分比,并通過ELISA測(cè)量TGF-β和IL-17的表達(dá)水平,評(píng)估Cav-1的表達(dá)對(duì)COPD患者不同時(shí)期的Th17、Treg細(xì)胞百分比及其細(xì)胞因子IL-17和TGF-β表達(dá)的影響。結(jié)果1.臨床資料分析在人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征方面對(duì)三組受試者進(jìn)行了比較:年齡、性別和體重指數(shù)(BMI)方面,組之間沒有差異。性別比例不平等主要是由于在中國(guó)吸煙者及COPD患者在男性中的流行率高于女性。肺功能測(cè)試結(jié)果顯示:與對(duì)照組(HC)相比,COPD患者的FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred均顯著降低,而RV/TLC與HC組相比顯著升高(P㩳0.01)。另外,AECOPD組患者與SCOPD組患者相比,FEV1值降低(P㩳0.05);FEV1/FVC、FEV1%pred顯著降低,RV/TLC顯著升高(P㩳0.01)。2.COPD患者血漿中Cav-1的水平和外周血中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的百分比為了研究Cav-1表達(dá)水平與Treg和Th17細(xì)胞的百分比之間的關(guān)系,我們通過ELISA測(cè)量血漿Cav-1的表達(dá),以及外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD4+IL-17+Th17細(xì)胞含量的百分比。在穩(wěn)定期COPD(SCOPD)和急性加重期COPD(AECOPD)以及健康對(duì)照(HC)受試者中的FCM,ELISA分析表明,與HC組相比,COPD患者的Cav-1水平顯著降低(P㩳0.01)。SCOPD患者的Cav-1水平明顯低于AECOPD患者(P㩳0.05)。除了降低的Cav-1水平,SCOPD組與AECOPD和HC組相比,Treg細(xì)胞的百分比顯著升高(P㩳0.01,P㩳0.05)。而與SCOPD和HC組相比,AECOPD組的Th17細(xì)胞的百分比顯著增加(P㩳0.01)。有意思的是,AECOPD患者外周血中Treg細(xì)胞的百分比顯著低于HC組。對(duì)于Th17細(xì)胞百分比的變化,SCOPD和HC組之間沒有顯著差異。我們的結(jié)果提示AECOPD患者的Th17/Treg比值最高,SCOPD患者的Th17/Treg比值與HC組相比顯著下降。3.COPD患者外周血中TGF-β和IL-17的水平患者的增強(qiáng)免疫抑制由Treg產(chǎn)生的免疫抑制細(xì)胞因子TGF-β的血漿水平的不同增量反映。在SCOPD患者體內(nèi),TGF-β明顯升高;相比之下,在患有AECOPD的患者中,Th17產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子IL-17的外周血水平顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)與循環(huán)中Treg和Th17細(xì)胞的百分比的變化一致。4.Cav-1表達(dá)水平與Treg和Th17細(xì)胞的百分比和Th17/Treg比值之間的相關(guān)性我們的實(shí)驗(yàn)觀察到HC組中Cav-1的水平與Treg和Th17細(xì)胞的百分比和Th17/Treg的比值沒有顯示任何相關(guān)性。COPD患者中Cav-1水平降低顯示與Treg細(xì)胞的百分比呈負(fù)相關(guān),與Th17細(xì)胞的百分比和Th17/Treg細(xì)胞的比值呈正相關(guān),提示Cav-1水平的變化在COPD患者體內(nèi)Th17/Treg比值失衡中可能起不可忽視的作用。5.Cav-1表達(dá)水平的變化影響Treg和Th17細(xì)胞的百分比為了評(píng)估Cav-1表達(dá)的改變是否影響Treg和Th17細(xì)胞的百分比,用Cav-1質(zhì)粒或Cav-1-si RNA轉(zhuǎn)染來(lái)自COPD的患者的PBMC,然后暴露于10%CSE 24小時(shí),如實(shí)驗(yàn)方法章節(jié)所述。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果分析顯示Cav-1的過表達(dá)導(dǎo)致Treg細(xì)胞的百分比降低和Th17細(xì)胞的百分比增加,而Cav-1的表達(dá)的下調(diào)促進(jìn)Treg細(xì)胞百分比的升高并降低Th17細(xì)胞的百分比,TGF-β和IL-17的表達(dá)水平的變化規(guī)律與Treg和Th17的百分比的變化規(guī)律一致。結(jié)論1.Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子均參與了COPD的發(fā)病過程,且兩者在COPD病情發(fā)展過程中的作用相反。COPD患者體內(nèi)存在Th17和Treg細(xì)胞比例的失衡,二者比值可以作為COPD疾病進(jìn)展的標(biāo)志。2.COPD患者體內(nèi)的Cav-1表達(dá)水平明顯降低。3.血漿Cav-1水平的降低能提高COPD患者外周血中Treg細(xì)胞的百分比并降低外周血中Th17細(xì)胞的百分比。4.COPD患者中Cav-1的表達(dá)水平與Treg細(xì)胞的百分比、TGF-β的水平呈負(fù)相關(guān),與Th17細(xì)胞的百分比、IL-17的水平和Th17/Treg細(xì)胞的比值呈正相關(guān)。5.Cav-1參與Th17/Treg之間的失衡,從而破壞COPD患者肺內(nèi)發(fā)生的炎癥性免疫反應(yīng),Cav-1表達(dá)的減少可能參與免疫耐受和抑制炎癥反應(yīng)。Cav-1促進(jìn)COPD患者中Th17/Treg比值失衡的詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R563.9

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本文編號(hào)：1268745