本文關鍵詞：Rock2穩(wěn)定β-catenin表達促進結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的研究

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【摘要】：研究背景和目的:結(jié)直腸癌是常見的消化道腫瘤。外科切除是治療結(jié)直腸癌的有效方法,但是切除術后癌癥的復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍較高。因此,闡明結(jié)直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的具體分子生物學機制,尋求更有效的治療結(jié)直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的新方法是腫瘤學領域的研究熱點。人Rho關聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶2(Human Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2,Rock2)是Rho家族的下游效應分子。研究發(fā)現(xiàn)Rock2基因在惡性腫瘤的發(fā)生和臨床進展過程中起重要作用,其可以調(diào)控許多細胞生物學功能,但其在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及具體作用機制仍不清楚。β-catenin是β-catenin/TCF4信號轉(zhuǎn)導通路中的關鍵效應蛋白,其在結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起重要作用。研究已經(jīng)證實,β-catenin蛋白經(jīng)過泛素化蛋白酶體降解。我們前期研究已經(jīng)報道Rock2可以調(diào)節(jié)底物蛋白如MMP2、Cdc25A的泛素化降解過程。因此我們推測:在結(jié)直腸癌中Rock2可能通過調(diào)節(jié)β-catenin的泛素化降解過程而影響β-catenin的表達。本研究首先分析Rock2基因在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義;其次通過體內(nèi)外實驗檢測Rock2基因在結(jié)腸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用;然后探討在結(jié)腸癌細胞中Rock2基因?qū)Ζ?catenin/TCF4通路的影響;最后明確Rock2調(diào)控β-catenin/TCF4信號通路的機制。本課題通過探討Rock2在結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的具體作用機制,將為闡明結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制提供理論依據(jù)。方法:采用qRT-PCR、免疫組化及Western blot等方法分析116例結(jié)直腸癌組織及對應癌旁組織中Rock2基因的mRNA和蛋白表達水平,并分析Rock2蛋白表達與患者臨床病理因素的關聯(lián)及其對預后的影響。運用qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)直腸癌細胞株SW480,SW620,LOVO,DLD-1和HCT-116中Rock2基因的表達情況;構建4個shRock2質(zhì)粒,利用qRT-PCR和Western blot篩選出最佳干擾效果的shRock2質(zhì)粒;采用Transwell實驗、細胞劃痕實驗檢測改變Rock2蛋白表達后對腫瘤細胞的侵襲和遷移能力的影響;采用人結(jié)腸癌裸鼠原位移植瘤模型檢測降低Rock2蛋白表達后對腫瘤轉(zhuǎn)移能力的影響。利用westernblot和熒光素酶報告基因檢測下調(diào)及上調(diào)結(jié)腸癌細胞中rock2的表達后對β-catenin蛋白及β-catenin/tcf4的轉(zhuǎn)錄活性的影響;另外,分別在結(jié)腸癌細胞中下調(diào)rock2表達的同時激活β-catenin/tcf4通路以及在上調(diào)rock2表達的同時阻斷β-catenin/tcf4通路,利用westernblot方法檢測β-catenin蛋白及相關下游靶基因的蛋白表達變化,同時利用transwell侵襲和遷移實驗檢測結(jié)腸癌細胞的遷移侵襲能力。利用免疫共沉淀及激光共聚焦技術,檢測結(jié)腸癌細胞中β-catenin蛋白和ub之間是否存在直接相互結(jié)合;利用蛋白酶體抑制劑mg132及放線菌酮(chx)刺激的方法,在阻斷蛋白降解及合成的情況下,利用westernblot檢測下調(diào)及上調(diào)rock2后對β-catenin蛋白表達的影響;利用免疫共沉淀檢測下調(diào)及上調(diào)rock2后對β-catenin的泛素化水平的影響。結(jié)果:qrt-pcr結(jié)果發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中rock2基因的mrna表達比對應的癌旁正常組織明顯增加(p0.001);免疫組化檢測結(jié)果顯示,rock2蛋白在62.07%(72/116)的結(jié)直腸癌組織中呈高表達,而在癌旁組織中僅有11.21%(13/116)呈高表達(p0.01);westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)rock2蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈明顯過表達與免疫組化結(jié)果一致。另外,統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌組織中rock2的高表達與患者的淋巴管浸潤(p0.001)、血管浸潤(p0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p0.001)、t分期(p0.001)、遠處轉(zhuǎn)移(p=0.011)和臨床分期(p0.001)密切相關。kaplan meier法分析5年生存曲線發(fā)現(xiàn)rock2高表達的結(jié)直腸癌患者的5年生存率明顯低于低表達的患者(p=0.027)。在sw480和lovo結(jié)腸癌細胞中加入rock2抑制劑(y27632)和轉(zhuǎn)染shrock2干擾質(zhì)粒后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)rock2基因的mrna和蛋白表達水平均明顯下降(p0.05),且發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的遷移和侵襲能力受到明顯抑制(p0.05);而在hct-116結(jié)腸癌細胞中轉(zhuǎn)染rock2過表達質(zhì)粒后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)rock2基因的mrna和蛋白表達水平顯著升高,同時發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的遷移和侵襲能力也隨之增強(p0.05)。此外,利用體內(nèi)實驗進一步發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定下調(diào)結(jié)腸癌細胞sw480中rock2基因的表達后可以降低裸鼠結(jié)腸癌遠處肝轉(zhuǎn)移(p0.05)。在sw480和lovo細胞中下調(diào)rock2的表達后發(fā)現(xiàn)β-catenin的蛋白表達、β-catenin/tcf4的轉(zhuǎn)錄活性及其下游靶基因hoxb9和mmp7的蛋白表達明顯降低(p0.05),而在下調(diào)Rock2表達的同時激活β-catenin/TCF4通路結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以明顯恢復β-catenin、HOXB9及MMP7的蛋白表達(p0.05)。同時,Transwell實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞的侵襲和遷移能力得到恢復。另外,在HCT-116細胞中上調(diào)Rock2的表達后發(fā)現(xiàn)β-catenin的蛋白表達、β-catenin/TCF4的轉(zhuǎn)錄活性及其下游靶基因HOXB9及MMP7的蛋白表達明顯增加(p0.05),而在上調(diào)Rock2表達的同時阻斷β-catenin/TCF4通路可以明顯抑制β-catenin、HOXB9及MMP7的蛋白表達(p0.05),同時Transwell實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞的侵襲和遷移能力受到明顯抑制(p0.05)。4、免疫共沉淀和激光共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細胞SW480和LOVO中β-catenin和Ub存在直接結(jié)合,且進一步發(fā)現(xiàn)利用蛋白酶抑制劑MG132阻斷蛋白降解后,內(nèi)源性β-catenin的蛋白表達量逐漸累積,說明在結(jié)腸癌細胞中β-catenin蛋白經(jīng)過泛素化蛋白酶體系統(tǒng)降解。在阻斷蛋白降解的情況下,下調(diào)或上調(diào)Rock2表達后,β-catenin蛋白表達表達無明顯變化,而在阻斷蛋白合成的情況下,β-catenin的降解速率明顯降低,說明Rock2參與了β-catenin蛋白的降解過程。另外,我們進一步發(fā)現(xiàn)Rock2可以穩(wěn)定β-catenin的蛋白表達。最后,我們降低結(jié)腸癌細胞中Rock2的表達后發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白的泛素化水平顯著升高,而增加Rock2的表達后發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白的泛素化水平顯著降低,說明Rock2通過影響β-catenin的泛素化水平而穩(wěn)定β-catenin蛋白的表達。結(jié)論:Rock2在結(jié)腸癌組織中明顯高表達,且與腫瘤的轉(zhuǎn)移及患者的不良預后密切相關。Rock2通過調(diào)節(jié)β-catenin蛋白的泛素化降解從而促進結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移,為β-catenin的調(diào)控提供了一條新途徑,有助于我們深入了解結(jié)直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的機制。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

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本文編號：1268359