本文關鍵詞：先天性泌尿系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒的遺傳學診斷

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【摘要】：背景和目的先天性泌尿系統(tǒng)發(fā)育異常(Congenital anomalies of the kidney and urinary tract,CAKUT)是一類多樣化的先天性結構畸形,主要由于腎臟在胚胎期發(fā)育缺陷所引起的。CAKUT在所有先天性結構畸形中占的比例約為20-30%,而在活產兒中的發(fā)病率約為3-6/1000。腎臟發(fā)育異常的疾病譜較為廣泛,從輕度腎積水到嚴重的雙側腎臟發(fā)育不良等。大部分CAKUT患者的病因至今仍然未知,但越來越多的證據顯示基因組的不平衡改變會導致泌尿系統(tǒng)的發(fā)育異常從而出現疾病狀態(tài)。人類和小鼠的遺傳學的進展使得我們對CAKUT的病理生理學有了進一步的了解。而與影響腎臟發(fā)育的轉錄因子或者信號轉導通路相關的基因發(fā)生突變則會導致CAKUT的出現。大量的研究數據顯示約有1/3的CAKUT患者是由于遺傳物質的改變如拷貝數變異、基因組異常以及新發(fā)的基因突變等所造成的。目前,臨床上應用遺傳學診斷的最大障礙仍然是基因型-表型之間相關性的知識的缺乏。然而,CAKUT遺傳學病因的鑒定將不僅對腎臟以外的并發(fā)癥診斷提供幫助,還有助于評估產后患者的腎臟功能和預后。目前用于檢測CAKUT新的致病基因的方法很多,主要包括候選基因研究、全基因組關聯(lián)分析、拷貝數變異(copy number variant,CNV)分析以及全外顯子組測序(whole exome sequencing,WES)。而后兩種方法目前越來越受歡迎。傳統(tǒng)的分析技術可以檢測大片段的染色體缺失/重復,主要有標準的核型分析技術和熒光原位雜交技術(fluorescent in situ hybridization,FISH),二者的分辨率介于500kb到5Mb之間。而5Mb的拷貝數變異片段(copy number variants,CNVs)只能由高分辨率的全基因組染色體微陣列分析技術(chromosomal microarray analysis,CMA)進行檢測。該技術主要包括微陣列比較基因組雜交技術(array comparative genomic hybridization,array-CGH)和單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(single nucleotide polymorphism microarrays,SNP-arrays)。這兩種類型的芯片平臺均具有高通量,高分辨率,周期短的特點,至少能檢測到500bp大小的CNVs。但均不能檢測染色體平衡性改變,如點突變等。目前對不明原因的疾病行遺傳學診斷常用的檢測流程是CNV分析再到WES。WES技術檢測范圍覆蓋基因組中的所有的編碼區(qū)域。人類外顯子組區(qū)域只占全基因組序列的~1%-2%,但覆蓋了~85%的已知致病基因突變位點。WES既可以用于檢測已知的疾病相關基因又可以發(fā)現新的疾病相關基因。在NIH的一項研究中發(fā)現WES可對將近20%的罕見疾病的患者進行基因診斷。本研究中,我們用傳統(tǒng)的染色體核型分析技術、染色體微陣列分析技術以及全外顯子測序技術對的453例CAKUT胎兒進行分析,旨在:1)分別從細胞、基因組和基因水平探討CAKUT胎兒的遺傳學病因;2)比較分析傳統(tǒng)的核型分析技術、CMA技術和WES技術在CAKUT胎兒中應用的優(yōu)越性和局限性;3)為建立先天性泌尿系統(tǒng)畸形的遺傳學診斷以及產前診斷的臨床操作流程提供理論依據。第一部分染色體核型分析技術和染色體微陣列技術在產前先天性泌尿系統(tǒng)異常胎兒中的應用方法1、選取2012年8月到2016年8月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產前診斷中心進行侵入性產前診斷的CAKUT胎兒樣本453例及其父母樣本。根據CAKUT(伴或不伴其他異常)亞型將胎兒樣本分為:腎臟回聲增強(n=21)、重復腎(n=25)、多囊性腎發(fā)育不良(n=73)、多囊性腎病(n=31)、腎積水(n=172)、腎臟增大伴或不伴回聲增強、腎發(fā)育不良(n=29)、腎缺如(n=64)、異位腎(n=13)、馬蹄腎(n=5)以及腎囊腫(n=5)。根據是否合并其他腎外異常將胎兒樣本分為3組:孤立性CAKUT組(n=324)、CAKUT合并軟指標組(n=62)和CAKUT合并其他系統(tǒng)畸形組(n=67)。2、選取得377例胎兒樣本,按照標準的操作流程進行細胞培養(yǎng)、G-顯帶染色體核型分析。3、用鹽析法血液DNA提取試劑盒I提取胎兒樣本(絨毛、羊水細胞和臍血)及其家系外周血白細胞中的全基因組DNA,并使用Sim-100對DNA的濃度和純度進行測量。4、根據美國Affymetrix公司的Cyto Scan HD芯片平臺(195萬拷貝數探針和75萬SNP探針)的標準實驗操作流程對210例胎兒樣本DNA進行處理,包括染色體核型異常11例,染色體核型結果正常123例以及首選CMA進行檢測的76例。5、使用相配套的CHAS軟件對掃描芯片產生的.CEL文件進行數據分析。6、根據DGV(含正常人的CNVs)、DECIPHER(含患者的表型及致病性片段)、OMIM(含已知的致病基因)、CAGdb、ISCA(含良性與致病性的CNVs)、UCSC Genome Browser(顯示片段中基因的內容及功能)及PUBMED等以及本實驗室的內部數據庫對分析結果進行在線比對,判斷CNVs的性質。7、針對致病性CNVs和臨床意義不明確的CNVs結果,進一步行父母樣本檢測進行綜合家系分析,明確CNVs的來源和性質。8、采用統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0中的卡方檢驗比較分析。結果1、453例CAKUT胎兒樣本中377例(83.22%,377/453)接受了染色體核型分析。結果顯示353例(77.92%,353/377)胎兒的染色體核型分析未見異常;而24例(6.37%,24/377)中可見異常。其中孤立性CAKUT組,染色體核型異常檢出率為3.97%(11/277);CAKUT合并軟指標組,檢出率為9.09%(5/55);CAKUT合并其他系統(tǒng)畸形組,檢出率為17.78%(8/45)。采用卡方檢驗進行兩兩比較,a=0.017為檢驗水準,結果發(fā)現孤立性CAKUT組和CAKUT合并其他系統(tǒng)畸形組異常檢出率之間的差異有統(tǒng)計學意義(3.97%vs 17.78%,P=0.001);其他組別之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P0.017)。2、24例核型異常的胎兒中11例進一步接受CMA檢測,結果發(fā)現4例含有致病性CNVs,1例含有VOUS,6例含有良性CNVs。3、353例核型結果正常的CAKUT胎兒中123例選擇進一步行CMA檢測,結果發(fā)現11例(8.94%)胎兒含有致病性CNVs;5例(4.07%)含有VOUS,107例(86.99%)含有良性CNVs。4、453例CAKUT胎兒樣本中76例未進行染色體核型分析,而是首選CMA進行檢測,結果發(fā)現16例(21.05%)胎兒含有致病性CNVs;其中CNVs10Mb的病例數為11例(14.47%,11/76),CNVs≤10Mb的病例數為6例,檢出率為7.89%(6/76)。3例(3.95%)患兒含有VOUS,57例(75%)患兒含有良性CNVs。采用卡方檢驗進行比較,a=0.05為檢驗水準,結果發(fā)現CMA一線檢測對10Mb的致病性CNVs檢出率和染色體核型分析結果異常的檢出率之間的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016);CMA一線檢測對≤10Mb的致病性CNVs檢出率與核型正常CAKUT胎兒的CMA結果之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.797)。5、210例接受CMA檢測的CAKUT胎兒病例中,孤立性CAKUT組致病性CNVs檢出率為10.88%(16/147),CAKUT合并軟指標組的為14.81%(4/27),CAKUT合并其他系統(tǒng)畸形組的為30.56%(11/36)。采用卡方檢驗進行兩兩比較,a=0.017為檢驗水準,結果發(fā)現孤立性CAKUT組和CAKUT合并其他系統(tǒng)畸形組致病性檢出率之間的差異有統(tǒng)計學意義(10.88%vs 30.56%,P=0.003);其他組別之間的差異無統(tǒng)計學意義(P0.017)。31例含有致病性CNVs的胎兒病例中,致病性檢出率依次為腎臟回聲增強33.33%(4/12)重復腎23.81%(5/21)多囊性腎發(fā)育不良23.53%(8/34)多囊性腎病17.65%(3/17)腎積水15.80%(9/57)腎臟增大伴或不伴回聲增強9.09%(1/11)腎發(fā)育不良7.69%(1/13)腎缺如、異位腎、馬蹄腎和腎囊腫(檢出率均為0)。6、210例接受CMA檢測的CAKUT胎兒病例中,31例含有致病性CNVs,其中染色體數目異常10例,占32.26%;已知的微缺失/微重復綜合征11例,占35.48%;其余11例(35.48%,11/31)為非綜合征致病性片段。此外,HNF1B、AGT和REN基因為已知的CAKUT致病性基因,而NPHP1、KCNJ1為CAKUT的候選基因。結論1、在CAKUT胎兒樣本中染色體核型異常的檢出率為6.37%,再次證明了泌尿系統(tǒng)異常的胎兒與染色體異常有相關性,尤其是合并其他系統(tǒng)畸形者。2、對于孤立性CAKUT,孤立性腎盂腎盞擴張和單側腎缺如病例沒有必要行染色體核型分析,但孤立性MCKD和HDN尚存在爭議,因此,產前孤立性CAKUT行染色體核型分析需慎重。3、CMA技術可以彌補了傳統(tǒng)核型分析的不足,進一步明確異常片段的大小、性質、來源以及片段內所含的基因,為產前咨詢和胎兒預后評估提供更確切遺傳學依據。4、CMA能將核型正常的CAKUT胎兒樣本的致病性CNVs的檢出率提高8.94%。同時具有識別致病基因的能力:HNF1B、AGT和REN基因為已知的CAKUT致病性基因,而NPHP1、KCNJ1為CAKUT的候選基因。5、CMA可以取代傳統(tǒng)核型分析技術應用于產前結構異常的胎兒中。但是CMA不能檢測平衡易位/倒位、組織嵌合體,也不是所有CMA均能檢測三倍體(array CGH),所以核型分析技術仍然需要用于臨床中以彌補CMA的不足。6、CAKUT合并其他系統(tǒng)畸形時基因組拷貝數變異的風險增加,不同的CAKUT亞型基因組拷貝數變異的風險也不同:腎臟回聲增強重復腎多囊性腎發(fā)育不良多囊性腎病腎積水腎臟增大伴或不伴回聲增強腎發(fā)育不良。7、本研究中17q12微缺失綜合征、22q11.2微缺失綜合征和Williams-Beuren綜合征較常見。而非綜合征型CNVs:16q13q24.3重復、2q14.3-q24.3重復、3p26.1微缺失、4q35.2微缺失、17p12微缺失、17p13.3微重復在CAKUT病例中首次報道,豐富了該類微缺失/微重復的疾病表型譜。8、CMA檢測后尚有較多VOUS和良性CNVs病例,不排除含有CMA分辨率以下的微缺失/微重復和基因突變的可能性,建議進一步行NGS檢測以明確診斷。第二部分全外顯子組測序技術在先天性泌尿系統(tǒng)異常胎兒中的應用方法1、選取2014年2月到2016年2月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產前診斷中心進行侵入性產前診斷的CAKUT伴或不伴其他畸形的胎兒樣本30例。染色體核型和CMA結果均未見明顯異常。其中22例為孤立性CAKUT樣本,8例為CAKUT合并其他異常樣本。根據是否用WES對核心家系進行檢測將胎兒樣本分為2組:G1組,即WES只對胎兒樣本進行檢測(n=23);G2組,即WES對核心家系進行檢測(n=7)。2、用鹽析法血液DNA提取試劑盒I提取胎兒樣本(絨毛、羊水細胞和臍血)及其家系外周血白細胞中的全基因組DNA,并使用Nanodrop分光光度計對DNA的濃度和純度進行測量。3、使用DNA文庫構建試劑盒,實驗步驟參照說明書依次進行末端補平、3’端腺苷化、接頭連接、片段選擇、擴增的過程,完成DNA文庫的構建。4、用Nimble Gen捕獲磁珠與Hybridization and Wash Kit試劑盒進行目標區(qū)域的捕獲,用高保真DNA聚合酶對目標區(qū)域進行PCR擴增。5、使用Hiseq 2500高通量模式,進行PE100測序,按Hiseq 2500標準流程進行作業(yè)。6、用Illumina官方basecall分析軟件Bcl To Fastq得到原始數據(raw data)。并轉換成FASTQ格式的文件。對原始數據進行過濾獲得高質量的數據(clean data)。然后依次進行數據比對、變異檢測、突變注釋、蛋白質危害性預測、剪切危害性預測以及生物學分析。7、突變位點根據ACMG(American College of Medical Genetics and Genomics)指南標準進行判定,分為以下5類:致病性、可能致病性、不明確、可能良性和良性。8、用一代測序(Sanger測序)的方法對致病性、可能致病性突變位點的胎兒及父樣本進行驗證。結果1、WES對30例核型及CMA結果未見異常的CAKUT伴或不伴其他異常的胎兒樣本進行檢測,結果在4例樣本中檢測到致病性突變,在2例樣本中檢測到偶發(fā)變異。WES在該CAKUT胎兒群體中致病性檢出率為13.3%(4/30)。2、4例致病性樣本中,孤立性CAKUT致病性檢出率為9.1%(2/22),而CAKUT合并其他異常的檢出率為25%(2/8)。3、致病性突變所涉及的基因分別為UMOD、NEK8、HNF1B和BBS2基因;偶發(fā)變異所涉及的基因分別為HSPD1和GRIN2B基因。4、G1組的周轉時間是11-12周,而G2組的周轉時間是8-9周。結論1、WES能提高產前診斷中不明原因的CAKUT胎兒的致病性檢出率,再次證明了CAKUT與單基因缺陷有相關性,尤其是合并其他異常的病例。為重復生育致死性CAKUT胎兒的家庭提供胚胎移植前診斷的可能性。2、有助指導孕期護理、評估胎兒的預后以及決定終止妊娠的時機。3、偶然發(fā)現一定程度上預防了很多疾病的發(fā)生,但也增加了成本支出。因此,建議遺傳學委員會致力于探討偶然發(fā)現對臨床醫(yī)生、患者/家屬以及廣大人群所造成的影響以進一步制定合理的方案。4、本研究在腎臟回聲增強的胎兒中檢測到致病性突變,但樣本量太少,尚不能確定WES在孤立性腎臟回聲增強胎兒中的應用價值。5、家系分析不僅能提高致病性檢出率,還能大大的減少一代測序驗證的成本以及在新的致病候選基因上鑒定出少量的突變。6、家系分析能加快WES分析的速度,縮短周轉時間。因此,盡管成本較高,但還是建議使用該分析模式,尤其在產前診斷中。
【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R714.5

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本文編號：1267530