本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌表觀遺傳與耐藥新機(jī)理研究

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【摘要】：結(jié)核病,一種古老的疾病,仍然是威脅人類健康的重要傳染性疾病之一,其致病菌是結(jié)核分枝桿菌。全世界大約有三分之一的人潛伏性患有結(jié)核病。據(jù)2016全球結(jié)核病報(bào)告統(tǒng)計(jì),2015年,全世界新發(fā)結(jié)核病數(shù)量約為1040萬例,其中中國患者約占總比例人數(shù)的7.7%,另外每年大約有140萬結(jié)核病患者死亡。結(jié)核病難以治愈的主要原因是由于其具有三大“武器”:毒力、持留性和抗生素耐受。蛋白質(zhì)賴氨酸乙�；且环N在真核生物和原核生物中是廣泛存在的,由賴氨酸乙�；负腿ヒ阴；杆呋目赡娴姆g后修飾,它在生物體的多種生理途徑如轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、細(xì)胞分裂或細(xì)胞死亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等扮演著重要角色。賴氨酸戊二酰化是最近剛發(fā)現(xiàn)的一種新型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,其在調(diào)控代謝途徑中發(fā)揮著重要作用。s RNAs(small RNA)是一種長度為50-500nt左右的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,其主要分為兩種類型:順式編碼sRNA和反式編碼sRNA,它們均可通過影響轉(zhuǎn)錄、翻譯、m RNA穩(wěn)定性等來發(fā)揮調(diào)控作用。sRNAs已經(jīng)被證明在細(xì)菌各種生理途徑如糖或氮代謝、鐵平衡、抗生素耐受中扮演著重要角色。因此,賴氨酸乙�；揎�、戊二�；蛃RNAs極有可能在結(jié)核分枝桿菌的毒力和抗生素耐受中發(fā)揮一定作用�；谝陨锨闆r,本論文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行工作研究:首先我們利用免疫親和富集和高靈敏度的質(zhì)譜聯(lián)用方法,對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的乙�；鞍踪|(zhì)和乙酰化為點(diǎn)進(jìn)行了檢測,總共鑒定到658個(gè)乙�；鞍踪|(zhì)和1128個(gè)乙酰化位點(diǎn),并利用GO富集分析等生物信息學(xué)方法對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行了初步分析,發(fā)現(xiàn)賴氨酸乙�；揎棊缀跎婕暗浇Y(jié)核分枝桿菌細(xì)胞所有生理途徑,可能具有廣泛的影響性,其中大量乙酰化的蛋白質(zhì)是與代謝途徑相關(guān)的。利用軟件motif-x對(duì)結(jié)核菌所有乙酰化的蛋白質(zhì)底物進(jìn)行了分析,鑒定出了6個(gè)呈現(xiàn)不同豐度的保守基序。通過數(shù)據(jù)挖掘和文獻(xiàn)收集,我們從中選取了與結(jié)核分枝桿菌毒力、持留、抗生素耐受有密切聯(lián)系的異檸檬酸裂解酶作為下一步的研究對(duì)象,在恥垢分枝桿菌中表達(dá)純化結(jié)核菌異檸檬酸裂解酶并通過質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)其可以在322位賴氨酸(k)乙�；�,這與組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定的位點(diǎn)相一致。此外,定點(diǎn)突變乙�；稽c(diǎn)測定酶活性,發(fā)現(xiàn)體外模擬乙�；^程的k322q突變蛋白的酶活性會(huì)大幅度降低,表明乙酰化會(huì)抑制異檸檬酸裂解酶的活性,并影響細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受。接著,我們采用生物信息學(xué)的方法,對(duì)結(jié)核分枝桿菌中的已鑒定的和功能未知的乙�；高M(jìn)行了系統(tǒng)性分析,最終發(fā)現(xiàn)47個(gè)假定的或已鑒定的乙酰化酶,對(duì)其進(jìn)行功能分類發(fā)現(xiàn)大多數(shù)乙�；笟w屬于中心代謝和呼吸類。此外通過blast等一系列生物信息學(xué)方法,發(fā)現(xiàn)一些乙�；冈跈C(jī)會(huì)性和非致病性分枝桿菌中存在同源蛋白質(zhì)。與結(jié)核分枝桿菌毒力基因數(shù)據(jù)比較分析,發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)乙酰化酶可能與毒力相關(guān)。交叉比較了乙�；笖�(shù)據(jù)和已報(bào)道的其他ptms組學(xué)數(shù)據(jù),結(jié)果表明只有一種乙�；�,rv2215,既可以被乙酰化也可以被琥珀�；臀於；�,也發(fā)現(xiàn)一種乙�；缚梢员灰阴；�,琥珀酰化和戊二�；揎�,此外,rt-pcr方法證明了許多乙�；缚赡芘c鄰近基因組成了同一操縱子。為了進(jìn)一步探究賴氨酸乙酰化修飾的作用,我們以恥垢分枝桿菌作為模式生物和研究對(duì)象,利用免疫親和富集和高靈敏度的質(zhì)譜聯(lián)用方法,對(duì)其乙�；鞍踪|(zhì)和乙�；稽c(diǎn)分布進(jìn)行了檢測,總共鑒定了345個(gè)乙酰化蛋白質(zhì)和620個(gè)乙�；稽c(diǎn)。生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)乙�；鞍踪|(zhì)具有廣泛的生物學(xué)功能和定位,鑒定了可能存在的6種乙酰化基序(kach,kacy,kacf和f*kac),并構(gòu)建了恥垢分枝桿菌第一張乙酰化蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)許多參與中心代謝的蛋白質(zhì)都被乙�；４送�,我們構(gòu)建了乙�；竢v0998的同源蛋白質(zhì)msmeg_5458的基因缺失菌株,發(fā)現(xiàn)該蛋白可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乙�；癄顟B(tài)進(jìn)而影響對(duì)抗生素異煙肼和十二烷基磺酸鈉敏感性;氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)果顯示賴氨酸乙�；梢愿淖儛u垢分枝桿菌大多數(shù)脂肪酸含量;通過差異蛋白質(zhì)乙�；M學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了可能為msemg_5458的102個(gè)蛋白質(zhì)乙酰化底物,在這些底物中包括參與分枝菌酸合成途徑與異煙肼耐受相關(guān)的inha蛋白質(zhì);定點(diǎn)突變方法和spottest實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示inha的乙�；皇菍�(dǎo)致缺失菌株對(duì)異煙肼耐受的原因;最后我們通過測定野生型菌株和缺失菌株中nad+和nadh含量,發(fā)現(xiàn)nad+/nadh比列的下調(diào)是導(dǎo)致缺失菌株對(duì)異煙肼耐受的原因。目前關(guān)于細(xì)菌中戊二�；芯�,僅僅集中在大腸桿菌上,對(duì)于致病菌尤其是結(jié)核分枝桿菌的戊二�；M學(xué)圖譜還沒有研究。為了更好理解結(jié)核分枝桿菌戊二�；植记闆r,我們利用抗賴氨酸戊二�；贵w的免疫親和富集以及質(zhì)譜聯(lián)合方法,鑒定了結(jié)核分枝桿菌中存在24個(gè)戊二�；鞍缀�41個(gè)戊二�；稽c(diǎn),其中有許多戊二�；鞍自诩�(xì)菌中是第一次報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)戊二酰化蛋白參與多種生物學(xué)途徑,如代謝,應(yīng)激反應(yīng)。此外,與結(jié)核分枝桿菌中其他翻譯后修飾組學(xué)數(shù)據(jù)比較分析,發(fā)現(xiàn)有15個(gè)蛋白既可以被戊二�；挚梢员灰阴；顽牾；�。值得注意的是,一些與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的包括HspX在內(nèi)的蛋白質(zhì)被戊二酰基化。最后本文研究了鐵穩(wěn)態(tài)主要調(diào)控元件IdeR蛋白質(zhì)的上游調(diào)控sRNAs和下游所調(diào)控的靶標(biāo)sRNAs。首先通過文獻(xiàn)搜集和數(shù)據(jù)挖掘,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能調(diào)控IdeR的s RNA,由IdeR編碼序列的反義鏈所編碼形成的順式編碼sRNA,ncRv2711c,并通過其特異性的DIG標(biāo)記探針進(jìn)行了Northern blot鑒定;隨后我們發(fā)展了一種可以快速、簡單、經(jīng)濟(jì)的鑒定sRNAs 5’末端和3’末端的新方法RJEM,并以已知5’末端和3’末端的大腸桿菌RyhB和結(jié)核分枝桿菌Mcr7 sRNAs為研究對(duì)象,對(duì)該方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證,并用該方法鑒定了ncRv2711c的5’末端和3’末端,確定了ncRv2711c的準(zhǔn)確長度;我們構(gòu)建了可以在四環(huán)素誘導(dǎo)下過表達(dá)ncRv2711c的重組結(jié)核分枝桿菌(ST377);通過測定其在不同培養(yǎng)基條件下的生長曲線,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ncRv2711c可以導(dǎo)致ST377在高鐵環(huán)境培養(yǎng)時(shí)生長明顯受到抑制,而在低鐵環(huán)境培養(yǎng)時(shí)生長無多大影響;Western blot結(jié)果顯示過表達(dá)ncRv2711c可以導(dǎo)致IdeR蛋白質(zhì)的水平下降,定量PCR結(jié)果顯示過表達(dá)ncRv2711c可以導(dǎo)致鐵儲(chǔ)存蛋白質(zhì)bfrB的轉(zhuǎn)錄水平的下降,鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)MbtB轉(zhuǎn)錄水平上升;通過對(duì)低鐵和高鐵培養(yǎng)條件下的結(jié)核分枝桿菌全RNA測序,最終鑒定了85個(gè)和鐵應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)的差異性sRNAs;生物信息學(xué)分析顯示這些s RNAs的長度大多數(shù)位于50-500nt,GC含量位于55%-70%左右;通過啟動(dòng)子基序分析和EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了IdeR蛋白質(zhì)可以結(jié)合到ncRv0281c的啟動(dòng)子區(qū)域上,測定野生型和缺失IdeR恥垢分枝桿菌中ncRv0281c啟動(dòng)子活性,發(fā)現(xiàn)IdeR可能正調(diào)控ncRv0281c的表達(dá)。但是Rv0281c蛋白質(zhì)與結(jié)核分枝桿菌鐵代謝之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證�？傊�,本文繪制了結(jié)核分枝桿菌乙酰化蛋白質(zhì)圖譜,確定了乙�；冈诳股啬褪苤邪l(fā)揮作用的事實(shí),并拓展了結(jié)核分枝桿菌sRNAs在鐵代謝中的調(diào)控通路的認(rèn)識(shí)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R378.911
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本文編號(hào)：1263195