本文關(guān)鍵詞：人胰島淀粉樣多肽損傷大鼠海馬神經(jīng)元的機(jī)制研究

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)與二型糖尿病(typeⅡdiabetes mellitus,DM2)是兩種常見的年齡相關(guān)性疾病。二者具有相似的流行病學(xué)及生物化學(xué)特征,且均與蛋白質(zhì)聚集,最終形成纖維狀結(jié)構(gòu)有關(guān)——胰島淀粉樣多肽(Amylin)聚集于DM2的胰腺組織,β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集于AD的腦組織。大量研究表明,兩種疾病具有明顯的相關(guān)性。Amylin寡聚體在腦內(nèi)的出現(xiàn)被認(rèn)為是導(dǎo)致AD發(fā)生發(fā)展的新危險(xiǎn)因素。雖然Amylin已被證實(shí),其聚集過程可改變內(nèi)鈣([Ca~(2+)]_i)穩(wěn)態(tài),進(jìn)而損傷胰島β細(xì)胞,但其神經(jīng)毒性機(jī)制仍不清楚。本文中,我們應(yīng)用離子成像、全細(xì)胞膜片鉗及免疫熒光等技術(shù),探究Amylin對大鼠海馬神經(jīng)元的損傷機(jī)制。大量報(bào)道指出,Aβ蛋白在細(xì)胞膜表面形成寡聚體的過程中,可以產(chǎn)生大量的ROS,從而破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。我們猜想高濃度hAmylin對神經(jīng)元的損傷機(jī)制可能與之相似。因此,我們借助免疫熒光、活細(xì)胞工作站及掃描電鏡,進(jìn)一步探究hAmylin對神經(jīng)元細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響。第一部分胰島淀粉樣多肽對大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)鈣的影響目的:分析不同來源、不同濃度的Amylin對原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i的影響及其機(jī)制。方法:培養(yǎng)原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)鑒定神經(jīng)元純度,及相關(guān)受體表達(dá)。利用鈣成像技術(shù)記錄神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i變化。利用免疫熒光觀察Amylin受體的表達(dá)量。利用透射電鏡觀察Amylin的聚集狀態(tài)。結(jié)果:1原代海馬神經(jīng)元純度鑒定神經(jīng)元細(xì)胞純度98%2 Amylin對原代海馬神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i的影響應(yīng)用不同濃度的hAmylin對原代大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)1-30μM的hAmylin可誘導(dǎo)神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i顯著增加(P0.05)。神經(jīng)元對3μM和10μM hAmylin的反應(yīng)率分別為38.46%和55.05%。10μM hAmylin可使R(340/380)增長67.6±17.5%,EC50約等于2.53μM。海馬神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i在給予10μM hAmylin約10 s后達(dá)峰,且可維持在峰值,無衰減。在撤藥洗脫后約30 s,[Ca~(2+)]_i可恢復(fù)至基線。重復(fù)給藥[Ca~(2+)]_i增加的峰值未見明顯變化(P0.05),說明沒有藥物脫敏現(xiàn)象。大約10%的神經(jīng)元在給予10μM鼠來源的Amylin(r Amylin)及普蘭林泰(hAmylin類似物,不發(fā)生聚集)后,產(chǎn)生[Ca~(2+)]_i增加現(xiàn)象。R(340/380)增長分別為22.1±4.0%和24.8±7.0%,與應(yīng)用10μM hAmylin相比,反應(yīng)顯著降低(P0.001)。10μM Amylin受體抑制劑AC187或AC253本身并不影響神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i,但可阻斷1μM hAmylin、10μM普蘭林泰及10μM r Amylin的作用,而10μM hAmylin所導(dǎo)致的[Ca~(2+)]_i增加現(xiàn)象不受影響。說明低濃度(1μM)hAmylin、10μM普蘭林泰及10μM r Amylin所引起的[Ca~(2+)]_i增加現(xiàn)象是一種受體依賴的機(jī)制,而高濃度(10μM)hAmylin所引起的內(nèi)鈣增加現(xiàn)象是一種非受體依賴的機(jī)制。3 Amylin受體RAMP在胎鼠海馬神經(jīng)元及成年大鼠腦片海馬區(qū)的表達(dá)應(yīng)用免疫熒光技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)Amylin受體RAMP1、2亞型在胎鼠海馬神經(jīng)元及大鼠腦片海馬區(qū)均有高表達(dá)。RAMP3亞型僅在胎鼠海馬神經(jīng)元高表達(dá),而成年大鼠腦片海馬區(qū)表達(dá)量較低。4濃度對hAmylin聚集的影響我們推測高濃度(10μM)hAmylin所誘導(dǎo)的[Ca~(2+)]_i增加與hAmylin的聚集有關(guān)。因此,我們應(yīng)用透射電鏡對hAmylin的聚集狀態(tài)進(jìn)行觀察。高濃度hAmylin(10μM)在37℃孵育1 h和24 h后,分別觀察到寡聚體及纖維狀結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。而在低濃度hAmylin(1μM)溶液中并未觀察到類似結(jié)構(gòu)。說明hAmylin誘導(dǎo)[Ca~(2+)]_i增加的非受體依賴機(jī)制,可能與其在高濃度下更容易出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊,產(chǎn)生寡聚體及纖維狀結(jié)構(gòu)的特性有關(guān)。第二部分人胰島淀粉樣多肽對TRPV4的興奮性調(diào)節(jié)作用目的:探究高濃度hAmylin誘導(dǎo)神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i增加的非受體依賴機(jī)制方法:培養(yǎng)原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元,利用鈣成像技術(shù)記錄神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i變化,利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞靜息電位。利用scRT-PCR,及siRNA技術(shù)探究TRPV4在hAmylin誘導(dǎo)[Ca~(2+)]_i增加反應(yīng)中的作用。結(jié)果:1神經(jīng)細(xì)胞膜鈣通透性離子通道與hAmylin誘導(dǎo)的[Ca~(2+)]_i增加細(xì)胞[Ca~(2+)]_i增加的來源只能是胞外鈣內(nèi)流或(和)胞內(nèi)鈣庫釋放。為探究hAmylin所誘導(dǎo)的[Ca~(2+)]_i增加是否來源于外鈣。我們使用了無鈣細(xì)胞外液,并加入0.1 m M EGTA鰲合殘存的外鈣。在無鈣外液中,10μM hAmylin誘導(dǎo)[Ca~(2+)]_i增加的現(xiàn)象消失。說明細(xì)胞膜上的鈣離子通道在hAmylin誘導(dǎo)[Ca~(2+)]_i增加的現(xiàn)象中扮演重要角色。為進(jìn)一步排除胞內(nèi)鈣庫釋放對該現(xiàn)象的影響,我們給予5μM環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶抑制劑,孵育1 min后,引起神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i增加。隨后,再次給予hAmylin仍可引起神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i的快速增加,且增加程度與不應(yīng)用CPA相比無明顯變化(P0.05)。用1μM毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)替代CPA,重復(fù)該實(shí)驗(yàn)得到相同結(jié)果。說明增加的[Ca~(2+)]_i主要來源于胞外鈣內(nèi)流,而非胞內(nèi)鈣庫釋放。2電壓門控性鈣離子通道與hAmylin誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i增加我們利用膜片鉗技術(shù)檢測hAmylin對神經(jīng)細(xì)胞膜靜息電位的影響。我們發(fā)現(xiàn)在給予hAmylin后,細(xì)胞膜靜息電位由-55.67±2.35m V上升至-35.00±2.80 m V。個(gè)別細(xì)胞還觀察到動作電位的產(chǎn)生�？紤]到細(xì)胞膜靜息電位去極化至-40 m V時(shí),即可激活L型鈣通道。因此我們認(rèn)為hAmylin誘導(dǎo)[Ca~(2+)]_i增加的現(xiàn)象有電壓門控性鈣離子通道參與。我們給予L型鈣通道阻斷劑氨氯地平(5μM)或N型鈣通道阻斷劑芋螺霉素(1μM)孵育1 min后,hAmylin誘導(dǎo)的R(340/380)增加率分別為44.49±13.84%和52.84±13.23%,與單獨(dú)應(yīng)用hAmylin(67.98±14.85%)相比,有明顯差異(P0.01)。說明電壓門控性鈣離子通道參與了hAmylin誘導(dǎo)神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i增加。然而,即便在同時(shí)給予氨氯地平和芋螺霉素時(shí),仍不能完全抑制hAmylin的作用,提示仍有其他的鈣通透性通道參與該反應(yīng)。3 hAmylin誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i增加依賴于外鈉參與為探究hAmylin導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜去極化的機(jī)制,我們用NMDG(一種不透過陽離子通道的大體積有機(jī)陽離子)代替了細(xì)胞外液中的Na+。在無鈉外液中,hAmylin誘導(dǎo)[Ca~(2+)]_i增加的現(xiàn)象被顯著抑制。反應(yīng)陽性率降至18.2%,反應(yīng)強(qiáng)度由65.39±15.91%降至34.34±4.57%(P0.001)。說明hAmylin誘導(dǎo)[Ca~(2+)]_i增加依賴于外鈉內(nèi)流,進(jìn)而使細(xì)胞膜去極化,膜靜息電位抬高。有趣的是,當(dāng)我們在正常外液中加入TTX(1μM)后,hAmylin誘導(dǎo)[Ca~(2+)]_i增加的現(xiàn)象無明顯變化(P0.05),說明電壓門控性鈉離子通道并不參與該反應(yīng)。甚至在無鈉外液中加入氨氯地平,仍然無法完全阻斷hAmylin誘導(dǎo)的[Ca~(2+)]_i增加現(xiàn)象。因此我們考慮,可能有非選擇性陽離子通道(如TRP家族)于上游進(jìn)行調(diào)控。4 TRPV4參與hAmylin誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i增加我們在給予TRP通道廣譜抑制劑RR(10μM)后,hAmylin誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i增加的現(xiàn)象被顯著抑制(P0.01)。靜息電位抬高了8.8±1.1 m V,與單獨(dú)應(yīng)用hAmylin(21.4±1.7 m V)相比,有顯著差異(P0.001)。為進(jìn)一步探究參與反應(yīng)的是TRP家族中的哪一種亞型,我們應(yīng)用單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)檢測hAmylin反應(yīng)陽性的海馬神經(jīng)元。發(fā)現(xiàn)6/7的陽性海馬神經(jīng)元表達(dá)TRPV4亞型,這與胰島β細(xì)胞的結(jié)果一致。之后,我們使用TRPV4通道的選擇性抑制劑HC067047(1μM)進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)hAmylin誘導(dǎo)神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i增加的現(xiàn)象被顯著抑制(P0.01)。靜息電位抬高7.4±1.1 m V,與單獨(dú)應(yīng)用hAmylin(21.4±1.7 m V)相比,有顯著差異(P0.001)。在成年SD大鼠的腦切片中,TRPV4在海馬區(qū)的表達(dá)很低,這與之前報(bào)道相一致。然而,在原代培養(yǎng)的SD大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元中,TRPV4在部分神經(jīng)元中表達(dá),陽性率為54%,這與鈣成像hAmylin反應(yīng)陽性率相一致。為進(jìn)一步確證TRPV4參與hAmylin誘導(dǎo)的[Ca~(2+)]_i增加,我們應(yīng)用TRPV4通道激動劑(GSK1016790A,100 n M)對海馬神經(jīng)元進(jìn)行干預(yù)。我們發(fā)現(xiàn)GSK1016790A與hAmylin誘導(dǎo)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i增加的現(xiàn)象總是相伴出現(xiàn)在同一神經(jīng)細(xì)胞。hAmylin的反應(yīng)低于GSK1016790A。我們利用siRNA技術(shù)將TRPV4通道敲低后,GSK1016790A及hAmylin誘導(dǎo)的[Ca~(2+)]_i增加較未敲低組顯著降低(P0.05)。說明TRPV4通道是hAmylin誘導(dǎo)神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i增加上游反應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn),這一結(jié)果與胰島β細(xì)胞的研究一致。為探究hAmylin是否可以直接激活TRPV4通道,我們對轉(zhuǎn)染TRPV4通道的HEK293細(xì)胞,直接給予GSK1016790A(100 n M)與hAmylin。發(fā)現(xiàn)GSK1016790A誘導(dǎo)[Ca~(2+)]_i增加的反應(yīng)仍然存在,而hAmylin誘導(dǎo)[Ca~(2+)]_i增加的反應(yīng)消失。說明hAmylin并非直接激活TRPV4通道,或其需要某些因素共同參與時(shí)才可激活該通道。第三部分人胰島淀粉樣多肽對細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響目的:探究hAmylin激活TRPV4的機(jī)制方法:培養(yǎng)原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元,應(yīng)用離子成像技術(shù)記錄神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i變化,線粒體膜電位的變化及ROS的生成。利用免疫熒光、活細(xì)胞工作站、掃描電鏡觀察hAmylin對細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響。結(jié)果:1 hAmylin聚集狀態(tài)的觀察我們將N端標(biāo)記FAM熒光的hAmylin加入細(xì)胞培養(yǎng)基中,37℃孵育15 min后,更換培養(yǎng)基,可觀察到聚合的hAmylin熒光。用新鮮培養(yǎng)基進(jìn)一步搖床洗脫之后,熒光消失。說明hAmylin更容易在細(xì)胞表面發(fā)生聚集,而沒有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。為分析hAmylin的聚合過程是否可逆,我們在更換培養(yǎng)基后,持續(xù)觀察聚合的hAmylin熒光12 h,熒光并未減少。說明hAmylin聚合的過程是不可逆的。2 hAmylin長時(shí)間作用對神經(jīng)元形態(tài)的影響我們利用活細(xì)胞工作站,對高濃度(10μM)hAmylin作用下的神經(jīng)元形態(tài)進(jìn)行長時(shí)間觀察。10μM hAmylin作用約4 h后,神經(jīng)元開始出現(xiàn)核固縮;約9 h后,可觀察到細(xì)胞凋亡。3 hAmylin對海馬組織的直接影響為了觀察hAmylin對海馬組織的直接影響,我們給成年大鼠側(cè)腦室注射5μL的10μM hAmylin,并于24 h后處死取腦,行冰凍切片。利用免疫熒光染色技術(shù),我們觀察到hAmylin導(dǎo)致的海馬區(qū)神經(jīng)元缺失。在我們的實(shí)驗(yàn)中,并未觀察到明顯的小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤,說明炎癥反應(yīng)并非造成神經(jīng)元缺失的主要原因。4 hAmylin對細(xì)胞膜完整性的影響我們猜想hAmylin誘導(dǎo)神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i增加可能與其寡聚體能在細(xì)胞膜表面形成非選擇性離子通透性孔道有關(guān)。我們對HEK293細(xì)胞給予10μM hAmylin 1 min,并未觀察到細(xì)胞[Ca~(2+)]_i的變化。在全細(xì)胞電壓鉗下也同樣未觀察到hAmylin引起電流變化。利用免疫熒光技術(shù),對神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)分別進(jìn)行特異性抗體染色。用hAmylin替代打孔劑Triton X-100后發(fā)現(xiàn)。神經(jīng)元經(jīng)短時(shí)間(1 min)hAmylin孵育后,鏡下即可觀察到免疫熒光。而膠質(zhì)細(xì)胞短時(shí)間(1 min)hAmylin孵育后,并未觀察到免疫熒光。若孵育時(shí)間延長至30 min,則神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞于鏡下均可觀察到相應(yīng)免疫熒光。說明hAmylin在細(xì)胞表面聚合過程中,確實(shí)可以導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性的破壞,使一抗進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但不同種類的細(xì)胞膜,所需孵育時(shí)間不同。這可能是導(dǎo)致hAmylin在短時(shí)間內(nèi),無法增加HEK293細(xì)胞[Ca~(2+)]_i的原因。為進(jìn)一步確證hAmylin對細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響,我們利用掃描電鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)經(jīng)hAmylin孵育后,神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞膜完整性遭到破壞。對HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染LifeAct質(zhì)粒,標(biāo)記細(xì)胞骨架(F-actin)后,在活細(xì)胞工作站中,觀察hAmylin長時(shí)間作用。結(jié)果顯示,10μM hAmylin的長時(shí)間作用同樣可對HEK293細(xì)胞的細(xì)胞骨架造成損傷。5 hAmylin對神經(jīng)元ROS生成及線粒體膜電位的影響有報(bào)道指出,Aβ蛋白破壞細(xì)胞膜完整性的機(jī)制主要與其在細(xì)胞表面聚合時(shí)生成ROS有關(guān)。我們猜想hAmylin破壞細(xì)胞膜完整性的機(jī)制可能與此相同。我們利用離子成像技術(shù),對神經(jīng)元ROS的生成進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)高濃度(10μM)hAmylin可以明顯增加神經(jīng)元ROS的生成(P0.001),而低濃度(1μM)hAmylin無此作用。說明ROS的生成主要與hAmylin的聚合有關(guān)。我們利用JC-1染料,進(jìn)一步觀察hAmylin對神經(jīng)元線粒體膜電位的影響。發(fā)現(xiàn)高濃度(10μM)hAmylin可以明顯降低線粒體膜電位,而低濃度(1μM)hAmylin無此作用。當(dāng)給予線粒體PTP開放抑制劑Cs A(1μM)后,高濃度(10μM)hAmylin所導(dǎo)致的線粒體膜電位降低現(xiàn)象被顯著抑制(P0.001),但不能抑制它所導(dǎo)致的[Ca~(2+)]_i增加及ROS的生成。說明hAmylin誘發(fā)的[Ca~(2+)]_i增加以及ROS生成還有其他機(jī)制。結(jié)論:hAmylin通過受體依賴及非受體依賴兩種機(jī)制誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i增加;低濃度hAmylin主要通過受體依賴機(jī)制,而高濃度hAmylin主要通過非受體依賴機(jī)制增加神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i。hAmylin在高濃度時(shí)容易發(fā)生錯(cuò)誤折疊,形成寡聚體作用于神經(jīng)元表面,激活TRPV4通道誘發(fā)細(xì)胞膜去極化,進(jìn)而激活電壓門控性鈣通道,導(dǎo)致神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i進(jìn)一步增加。隨著hAmylin寡聚體在神經(jīng)細(xì)胞表面聚集時(shí)間延長,細(xì)胞膜完整性受損、ROS生成增加以及線粒體膜電位下降,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R749.16;R587.1

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6 葉偉;裘燕;劉富鑫;鐘偉霞;羅建紅;;咪唑安定對小鼠海馬神經(jīng)元放電模式的影響[A];Proceedings of the 8th Biennial Conference of the Chinese Society for Neuroscience[C];2009年

7 石素琴;蔡志平;霍東升;石巖;賈建新;;海馬神經(jīng)元的掃描電鏡觀察[A];科技創(chuàng)新與經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)調(diào)整——第七屆內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)學(xué)術(shù)年會優(yōu)秀論文集[C];2012年

8 蔡志平;霍東升;石素琴;李朝暉;賈建新;方剛;張明;;新生大鼠海馬神經(jīng)元的體外培養(yǎng)[A];科技創(chuàng)新與經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)調(diào)整——第七屆內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)學(xué)術(shù)年會優(yōu)秀論文集[C];2012年

9 張明;蔣莉;郭藝;;大鼠海馬神經(jīng)元無血清原代培養(yǎng)及膜電位測定[A];中華醫(yī)學(xué)會第十四次全國兒科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

10 胡祁生;陳靜芳;王勇;湯劍青;萬曙霞;魏勁波;;川芎嗪對海馬神經(jīng)元電活動的調(diào)制作用[A];中國生理學(xué)會第21屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;海馬神經(jīng)元損傷及保護(hù)的納米級三維構(gòu)像變化研究[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張瑋;大鼠腦缺血—再灌注損傷時(shí)SGK1信號途徑在海馬神經(jīng)元保護(hù)的機(jī)制研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

2 張靜;氧糖剝奪后海馬神經(jīng)元中AP4M1表達(dá)變化及其對AMPA受體運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控作用[D];鄭州大學(xué);2014年

3 陳謙峰;固本健腦法對AD細(xì)胞模型的作用及Caveolin-1、P-tau影響的研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2015年

4 陳靜;缺血后適應(yīng)對樹，

本文編號：1262050