本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌臨床菌株中Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的鑒定與功能研究

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【摘要】：金黃色葡萄球菌是人類重要的病原細(xì)菌,可引起多種感染性疾病。面對(duì)來(lái)自宿主和環(huán)境的壓力,金黃色葡萄球菌不斷地進(jìn)化以提高自身的適應(yīng)能力,從而抵抗真核宿主的免疫系統(tǒng)及環(huán)境中的殺菌因素。其適應(yīng)環(huán)境的主要方式之一是通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移獲取可移動(dòng)遺傳元件如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子及噬菌體之上的毒力和抗生素抗性相關(guān)基因。原核生物中成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats[CRISPR]-CRISPR associated proteins[Cas])組成CRISPR-Cas系統(tǒng),具有特異性靶向入侵核酸的功能,其靶標(biāo)主要是噬菌體和質(zhì)粒等可移動(dòng)元件。目前為止,國(guó)外有幾個(gè)金黃色葡萄球菌臨床菌株被發(fā)現(xiàn)含有Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng),但沒(méi)有相關(guān)的功能研究報(bào)道。在金黃色葡萄球菌的近親表皮葡萄球菌RP62a中,其Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫功能已經(jīng)得到驗(yàn)證。此外,有研究發(fā)現(xiàn)一些Ⅰ型和Ⅱ型系統(tǒng)還參與了細(xì)菌的生理和毒力調(diào)控過(guò)程。國(guó)內(nèi)金黃色葡萄球菌臨床菌株中CRISPR-Cas系統(tǒng)的分布情況,其免疫功能及其他生理調(diào)節(jié)功能,在本研究之前都未見(jiàn)報(bào)道。本論文主要進(jìn)行了三個(gè)方面的工作:首先,我們根據(jù)三個(gè)已報(bào)道CRISPR-Cas系統(tǒng)的序列設(shè)計(jì)了針對(duì)四個(gè)cas基因用于PCR篩選的簡(jiǎn)并引物。最終我們從六百多個(gè)臨床菌株中得到6個(gè)含Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的金黃色葡萄球菌臨床菌株,并隨后對(duì)這六個(gè)菌送樣進(jìn)行了全基因組二代重測(cè)序。其中5個(gè)新篩選菌株與已報(bào)道菌株有相似的CR]ISPR序列,但MLST,spa分型顯示它們?cè)诜N系發(fā)生上距離較遠(yuǎn)。這說(shuō)明CRISPR-Cas系統(tǒng)可以在菌株間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移,而不僅僅通過(guò)垂直遺傳的方式進(jìn)行傳播。在已報(bào)道菌株和新發(fā)現(xiàn)的5個(gè)MRSA菌株中,CRISPR-Cas系統(tǒng)都與SCCmec鄰近,這提示CRISPR-Cas系統(tǒng)的整合位點(diǎn)可能在基因組上SCCmec插入位置的附近。對(duì)CRISPR序列的分析發(fā)現(xiàn),葡萄球菌中Ⅲ-A型系統(tǒng)的重復(fù)序列(repeat)具有高度保守性,而間隔序列(spacer)的同源序列大部分發(fā)現(xiàn)于噬菌體中裂解區(qū)的模板鏈上。此外,對(duì)六個(gè)菌株的比較發(fā)現(xiàn),spacer數(shù)量較少的AH1菌株含有比其他五個(gè)菌株更多的抗性基因和毒性基因,這也許與CRISPR-Cas系統(tǒng)阻止可移動(dòng)元件轉(zhuǎn)移的功能有關(guān)。同時(shí),我們?cè)贏H1菌株中進(jìn)行了 CRISPR-Cas系統(tǒng)免疫功能與機(jī)制的研究。質(zhì)粒侵染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌的Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)可以阻止含spacer同源序列質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移,且此過(guò)程依賴于靶序列的轉(zhuǎn)錄。對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別需要crRNA與靶標(biāo)RNA的序列互補(bǔ),其中在crRNA 5'端的堿基配對(duì)比3'端的更重要。CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫功能還依賴于Cas蛋白,其中核酸內(nèi)切酶Cas6和Csm各組分參與了此過(guò)程。此外,為了研究臨床金黃色葡萄球菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)除免疫之外的功能,我們對(duì)AH1,AH3和SH3三個(gè)菌及它們的CRISPR序列敲除菌株進(jìn)行了 RNA-seq。高通量測(cè)序數(shù)據(jù)顯示,在三個(gè)菌株中各自的CRISPR影響了不同基因的表達(dá)。其中在AH3菌株中,CRISPR敲除導(dǎo)致了包括氮代謝和毒性相關(guān)基因在內(nèi)的一些基因群的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化。Real-time PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)了毒力基因spa和sspABC及調(diào)控因子sarS在轉(zhuǎn)錄水平的改變。通過(guò)以上研究,我們?cè)谂R床菌株中確定了金黃色葡萄球菌CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)識(shí)別依賴于crRNA與靶RNA的序列互補(bǔ),而Cas6和CSM復(fù)合物對(duì)于免疫功能是必需的。對(duì)于免疫之外的功能,我們發(fā)現(xiàn)CRISPR在金黃色葡萄球菌可參與調(diào)節(jié)毒性相關(guān)基因的表達(dá),但是其中的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究確定。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R378.11;Q78

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本文編號(hào)：1260646