本文關(guān)鍵詞：Stathmin作為胃癌基因治療新靶點(diǎn)的機(jī)理研究

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【摘要】：前言胃癌(Gastric cancer,GC)是一種發(fā)病率及死亡率均較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,嚴(yán)重影響我國人民的健康壽命。胃癌早期就存在轉(zhuǎn)移傾向,因此,超過百分之五十的患者發(fā)病時(shí)已被診斷為腫瘤晚期。雖然手術(shù)切除是胃癌治療的主要方法,然而大多數(shù)患者在疾病診斷時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,喪失了手術(shù)機(jī)會,從而限制了手術(shù)方式的應(yīng)用及治療效果。全身化療是局部復(fù)發(fā)以及晚期轉(zhuǎn)移不可手術(shù)胃癌患者的首選方案,然而臨床效果令人失望。研究表明化療客觀反應(yīng)率僅達(dá)20～40%,中位總生存期(overall survival,OS)只有6～11個(gè)月。而且.目前臨床治療上也缺乏標(biāo)準(zhǔn)化療方案,所以患者生存情況并不樂觀。為此,近年來,研究人員致力于發(fā)現(xiàn)新的胃癌特異性生物標(biāo)志并探索新的臨床治療手段,以提高胃癌的早診率,改善胃癌患者的預(yù)后。在腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域,分子靶向治療引起廣泛關(guān)注,以提高抗癌療效的特異性,降低耐藥性和非選擇的毒性。目前已開展多個(gè)針對胃癌分子靶向治療作用機(jī)制臨床試驗(yàn),如表皮生長因子、胰島素樣生長因了受體、c-Met、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、關(guān)鍵酶、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路以及調(diào)節(jié)血管生成、免疫檢查點(diǎn)阻斷等。曲妥珠單.克隆抗體是最先被批準(zhǔn)用于胃癌標(biāo)準(zhǔn)治療分子靶向藥。ToGA臨床實(shí)驗(yàn)表明,曲妥珠單抗與全身化療聯(lián)合可改善人類表皮生長因子受體(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER-2)陽性表達(dá)晚期胃癌患者生存期,共同治療效果顯著優(yōu)于單純化療。然而HER-2標(biāo)記在胃癌患者表達(dá)率及擴(kuò)增數(shù)很低,僅為6～23%,限制了其臨床治療應(yīng)用。2014年4月,基于RAINBOW臨床試驗(yàn)的結(jié)果,人血管內(nèi)皮生長因子受體2拮抗劑ramucirumab被美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)審批上市,與化療聯(lián)合治療二線或一線化療失敗進(jìn)展期胃癌及胃食管結(jié)合部腺癌。我國自主研發(fā)的抗血管生成小分子酪氨酸酶抑制劑甲磺酸阿帕替尼可顯著改善二線化療失敗晚期胃腺癌患者總生存期(OS)。除此之外,其他許多針對胃癌的靶向藥物均未取得令人滿意的臨床治療效果。Stathmin是一種廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,作為參與微管(microtubule,MT)聚合的關(guān)鍵蛋白之一,在有絲分裂過程及其他各種生命活動中起著至關(guān)重要的作用。通過其自身位點(diǎn)的磷酸化和去磷酸化,影響微管系統(tǒng)的動力學(xué)穩(wěn)定性,調(diào)控細(xì)胞周期,最終導(dǎo)致細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生變化。Stathmin表達(dá)受許多轉(zhuǎn)錄因子、激酶以及磷酸化酶等調(diào)節(jié)與控制,通過調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞微管動力學(xué)、細(xì)胞增殖、活性以及凋亡等過程,對惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、分子診斷及療效預(yù)后預(yù)測等方面均具有重要意義。近年來的研究發(fā)現(xiàn):Stathmin于多種腫瘤組織中過表達(dá),跟惡性腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、疾病TNM分期及臨床預(yù)后具有顯著關(guān)聯(lián)。在前期研究工作中,我們初步檢測了 2種胃癌細(xì)胞系(SGC7901和MGC803)、8例胃癌患者術(shù)后切除腫瘤組織以及癌旁正常組織中Stathmin表達(dá)情況,結(jié)果表明Stathmin在2種胃癌細(xì)胞系及胃癌組織均有高表達(dá),而于癌旁組織中僅呈弱陽性或不表達(dá)。提示Stathmin在胃癌細(xì)胞分化、增殖進(jìn)程中可能發(fā)揮重要意義和作用。桔抗或阻斷Stathmin可影響腫瘤細(xì)胞的有絲分裂、生長、轉(zhuǎn)移、存活和腫瘤克隆形成、細(xì)胞周期受阻于G2/M期以及凋亡率增加。Stathmin水平異常升高與微管依賴過程密切相關(guān),影響以微管蛋白為作用靶點(diǎn)的化療藥物療效,從而可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥�？紤]抗Stathmin治療與多西他賽兩者均以微管通路作為藥物靶點(diǎn),我們推測兩者的聯(lián)合應(yīng)用可能具有協(xié)同抗腫瘤作用。阻斷Stathmin表達(dá)及抑制其生物學(xué)功能將可能成為一種癌癥治療方式。迄今為止,尚未有針對Stathmin與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性及診治影響的系統(tǒng)研究。Stathmin在胃癌腫瘤進(jìn)程中所起到的介導(dǎo)功能及內(nèi)在的作用機(jī)制尚不清楚�；谇捌谠囼�(yàn)結(jié)果,我們擬通過檢測胃癌患者腫瘤組織標(biāo)本及癌旁正常組織標(biāo)本Stathmin表達(dá)水平,研究其與胃癌臨床診斷、治療以及預(yù)后因素之間關(guān)聯(lián)性,以期為胃癌分子標(biāo)志物篩選提供思路;分析其與化療敏感性及生存率的相關(guān)性,有助于臨床指導(dǎo)胃癌化療藥物的選擇及預(yù)后的判斷;通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證 Stathmin 反義寡脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)對胃癌細(xì)胞生長、凋亡影響;明確Stathmin抑制劑和化療藥物多西他賽對胃癌細(xì)胞增殖協(xié)同治療療效。本研究將為胃癌的診療策略提供更充分的臨床證據(jù),探尋胃癌治療的潛在的分子標(biāo)記物和靶點(diǎn)。第一部分Stathmin在胃癌組織表達(dá)的意義及其與化療療效、預(yù)后的相關(guān)性目的1.應(yīng)用免疫組化、Western Blot方法檢測Stathmin在人胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況;2.研究Stathmin表達(dá)與胃癌患者腫瘤細(xì)胞分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床特征的關(guān)系,以期為胃癌分子標(biāo)志物的篩選提供思路;3.探討Stathmin表達(dá)與化療藥物有效性及胃癌患者生存率的相關(guān)性,為臨床指導(dǎo)胃癌患者化療藥物的選擇及預(yù)后的判斷提供依據(jù)。材料與方法本實(shí)驗(yàn)納入山東省千佛山醫(yī)院2009年1月至2009年12月進(jìn)行手術(shù)切除治療(根治術(shù)、姑息性切除術(shù))或組織活檢并經(jīng)病理明確診斷的胃腺癌患者56例,分別取其胃癌組織標(biāo)本及其癌旁組織標(biāo)本,所有患者診斷前均未接受放療、化療及微創(chuàng)治療,所有病理切片均遵照全國胃癌協(xié)作組標(biāo)準(zhǔn)診斷并由病理科醫(yī)師進(jìn)行復(fù)檢。采用免疫組化、Western Blot方法檢測胃癌及癌旁組織中Stathmin表達(dá)水平;研究其表達(dá)與胃癌臨床診治、預(yù)后等相關(guān)生物學(xué)特征的關(guān)系;通過探索Stathmin表達(dá)水平與DC(多西他賽和順鉑)方案化療的有效率、臨床受益率、1年及3年生存率等相關(guān)性研究,為個(gè)體化治療方案的制定提供依據(jù)。結(jié)果:1.Stathmin在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果示Stathmin陽性顯色顆粒呈棕黃色或褐色,癌組織區(qū)域內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞呈陽性染色反應(yīng),但在癌旁標(biāo)本中的表達(dá)則明顯減弱。此外,我們還通過western blot法檢測了胃癌及癌旁正常組織中Stathmin的表達(dá)水平。Stathmin蛋白的表達(dá)水平在腫瘤組織中明顯增高。在所有標(biāo)本中,癌組織中Stathmin蛋白的陽性表達(dá)率為71.4%,而癌旁組織的表達(dá)率僅為37.5%(P0.05)。2.Stathmin表達(dá)與胃癌的臨床病理資料分析通過分析Stathmin表達(dá)與胃癌的臨床病理資料,Stathmin表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度(P0.001)、腫瘤浸潤深度(PO.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.001)均正相關(guān),而與性別(P0.05)及年齡(P0.05)無關(guān)。3.Stathmin與化療療效及預(yù)后分析Stathmin陽性表達(dá)組的化療有效率、臨床獲益率分別為10.5%、52.6%,均低于陰性表達(dá)組23.1%、69.2%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(有效率P=0.022,臨床獲益率P=0.020,均0.05)。對兩組患者進(jìn)行隨訪1年、3年發(fā)現(xiàn),兩組1年生存率、3年生存率均無顯著性差異(P均0.05)。結(jié)論:Stathmin蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率較癌旁正常組織明顯升·高。Stathmin蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度及腫瘤TNM臨床分期等預(yù)后指標(biāo)均正相關(guān),而與性別及年齡無明顯相關(guān)性。Stathmin陽性表達(dá)組的化療療效、臨床獲益率均降低,但對生存率及生存期無明顯影響。Stathmin的表達(dá)水平將是胃癌預(yù)后分子標(biāo)志物之一,可作為化療療效評估的一個(gè)參考指標(biāo)。第二部分Stathmin基因反義核酸對胃癌細(xì)胞生長、成瘤的作用研究目的:1.體外實(shí)驗(yàn)研究StathminASODN對胃癌細(xì)胞系生長和凋亡過程的作用機(jī)制。2.動物實(shí)驗(yàn)研究Stathmin ASODN對荷瘤小鼠的腫瘤生長的抑制作用。3.體外實(shí)驗(yàn)評估StathminASODN聯(lián)合多西他賽對胃癌細(xì)胞生長調(diào)控的作用機(jī)制。材料方法:1.采用 StathminASODN 及正義寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide,SODN)轉(zhuǎn)染胃癌SGC 7901細(xì)胞。2.RT-PCR方法檢測ASODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞、SODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對照組未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的StathminmRNA表達(dá)水平。Western blot方法檢測Stathmin蛋白的表達(dá)水平。3.MTT法檢測SGC 7901細(xì)胞的增殖能力。4.觀察StathminASODN、SODN處理的SGC 7901細(xì)胞,以及未經(jīng)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞倍增時(shí)間的差異。5.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析抗Stathmin治療對胃癌細(xì)胞凋亡的影響。6.觀察StathminASODN、SODN轉(zhuǎn)染的裸鼠胃癌移植瘤的生長情況、測量瘤徑。結(jié)果:1.StathminASODN對體外培養(yǎng)的人胃癌SGC 7901細(xì)胞系增殖的影響采用ASODN及SODN轉(zhuǎn)染人胃癌SGC 7901細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染72 h之后,采用RT-PCR檢測ASODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞、SODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對照組未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 StathminmRNA 表達(dá),分別為 0.21±0.08、1.01±0.43 和 1.44±0.54。ASODN和SODN轉(zhuǎn)染組表達(dá)水平兩者之間存在顯著差異(P0.01)。Western blot方法檢測結(jié)果示:與SODN轉(zhuǎn)染組比較,ASODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的Stathmin蛋白水平下降。MTT結(jié)果顯示:與SODN治療組相比,不同濃度Stathmin ASODN組SGC 7901細(xì)胞的增殖均被顯著抑制(P0.05);該抑制作用在72小時(shí)達(dá)到高峰,最佳治療濃度為20μmol/L;細(xì)胞倍增時(shí)間延長。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示:Stathmin ASODN組早期凋亡細(xì)胞增多,凋亡率增加。2.StathminASODN對荷瘤小鼠胃癌移植瘤生長的影響Stathm in AS ODN轉(zhuǎn)染的裸鼠胃癌移植瘤生長速度較對照組明顯減緩。StathminASODN轉(zhuǎn)染裸鼠的腫瘤大小(平均直徑)為4.04±0.17mm3,顯著低于SODN組(8.01 ±0.21 mm3),兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P0.05)。3.StathminASODN和多西他賽聯(lián)合治療對人胃癌SGC 7901細(xì)胞增殖的影響多西他賽可以抑制SGC 7901細(xì)胞的增殖,并呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。與StathminASODN聯(lián)合處理細(xì)胞時(shí),對細(xì)胞增殖活性的抑制作用更為顯著,因此兩者的聯(lián)合治療明顯優(yōu)于多西他賽單獨(dú)處理組(P0.05)。結(jié)論:1.體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Stathmin ASODN顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖,Stathmin可能是胃癌治療的一個(gè)潛在分子標(biāo)志物和靶點(diǎn)。2.StathminASODN增強(qiáng)多西他賽對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用,表明兩者聯(lián)合治療的協(xié)同效果,提示抗Stathmin靶向治療與化療具有協(xié)同抗腫瘤治療作用,聯(lián)合治療的臨床獲益更大。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：1260549