發(fā)布時間：2017-12-06 01:17

  本文關(guān)鍵詞：南蛇藤莖提取物調(diào)控Notch1抑制肝癌血管擬態(tài)的作用及機制

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【摘要】：引言原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種高度異質(zhì)性、癌性血管豐富的惡性實體腫瘤,早期診斷率低。根治性切除或肝臟移植后大部分病例在2年內(nèi)形成肝內(nèi)復(fù)發(fā)或肝外轉(zhuǎn)移,5年生存率較低。中晚期患者由于受基礎(chǔ)肝功能的影響,目前尚缺乏反應(yīng)率高且相對安全的治療措施。因此肝癌的綜合治療策略亟待進(jìn)一步研究及補充。傳統(tǒng)的抗內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管(endothelial dependent vessel,EDV)生成在實體腫瘤治療中的不理想,提示了可能存在另外一種相對獨立的微血管系統(tǒng)參與腫瘤血供。擬態(tài)血管(vasculogenic mimicry,VM)是由腫瘤細(xì)胞獨立形成的、參與腫瘤血供及轉(zhuǎn)移的微血管結(jié)構(gòu),它的形成是腫瘤細(xì)胞自身塑性改變以及腫瘤細(xì)胞與局部微環(huán)境相互作用的結(jié)果,多種腫瘤基因及血管生成調(diào)節(jié)基因參與其中。惡性腫瘤中VM的形成多與不良預(yù)后密切相關(guān)。Notch基因目前發(fā)現(xiàn)4種(Notch1-4)亞結(jié)構(gòu),是哺乳動物胚胎發(fā)育過程中重要的調(diào)控基因。在胚胎后的腫瘤形成及進(jìn)展、組織纖維化、血管生成中發(fā)揮重要作用。Notch基因在黑色素瘤及乳腺癌的血管擬態(tài)中均發(fā)揮重要作用。而關(guān)于Notch1在肝癌血管擬態(tài)形成中的作用及機制,目前鮮有報道。肝癌中醫(yī)稱為肝積,屬于現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合理論中的絡(luò)病范疇。肝癌的血管生成是一種病絡(luò)的綜合表現(xiàn),其病機要素為“虛、瘀、毒”。病絡(luò)是肝癌生長和轉(zhuǎn)移的主要途徑。理論上講肝癌的血管擬態(tài)亦是一種病絡(luò)。根據(jù)“辛以通絡(luò)”原則,辛藥具有活血祛瘀、解毒散結(jié)功效的可發(fā)揮抑制病絡(luò)的作用。目前一些基礎(chǔ)研究顯示具備上述性味的中藥能夠抑制血管擬態(tài)的形成。南蛇藤(Celastrus Orbiculatus Thunb)系衛(wèi)茅科藤屬藥用植物,全草入藥,苦溫微辛,入肝與膀胱經(jīng),功能行氣活血、祛毒消腫。課題組前期的研究證實南蛇藤莖乙酸乙酯提取物(Celastrus Orbiculatus Extraction,COE)能夠抑制肝癌的內(nèi)皮依賴性血管生成;抑制胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)減少胃癌裸鼠模型的轉(zhuǎn)移。但是,關(guān)于COE能否調(diào)控Notch1抑制肝癌的血管擬態(tài),目前未檢索到相關(guān)的文獻(xiàn)報道。為此,本研究圍繞這一核心問題,從以下四個部分展開相應(yīng)的研究,力圖證實:1)Notch1在肝癌血管擬態(tài)中的作用及可能的機制;2)COE能否通過調(diào)控Notch1抑制血管擬態(tài),進(jìn)而抑制肝癌的生長。通過本課題的開展,以期為肝癌的中醫(yī)藥治療提供理論及實驗依據(jù)。本課題共分為四個研究部分。第一部分Notch1在肝癌組織中的表達(dá)及其與血管擬態(tài)的關(guān)系目的:檢測Notch1及其下游靶蛋白Hes1、EMT相關(guān)蛋白E—cadherin及vimentin在肝癌組織中的表達(dá)水平,分析Notch1、EMT與肝癌VM的相關(guān)性;揭VM在肝癌進(jìn)展預(yù)后中的臨床意義。方法:收集肝癌手術(shù)標(biāo)本,并根據(jù)標(biāo)本來源信息對患者進(jìn)行追蹤隨訪。免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemical staining,IHC)檢測 Notch1、Hes1 及 EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá),以RT-PCR進(jìn)行驗證。PAS-CD34雙染色檢測VM,分析各蛋白表達(dá)水平與VM的相關(guān)性。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制肝癌患者術(shù)后生存曲線,比較有無VM對術(shù)后復(fù)發(fā)的影響。結(jié)果:在收集的44例肝癌標(biāo)本中,Notch1及Hes1在肝癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織明顯上調(diào)(P0.001)。共 17 例(38.64%,17/44)檢出 VM 結(jié)構(gòu),Notch1、Hes1 的表達(dá)水平與 VM 檢出率呈正性相關(guān)(r=0.590,0.568,P0.001、0.001)。12 例(27.27%,12/44)檢出肝癌細(xì)胞中vimentin表達(dá),陽性率與VM呈正性相關(guān)(r=0.963,P0.001)。Notch1表達(dá)水平在Vimentin陽性標(biāo)本中顯著提高(P0.001)。Kaplan-Meier生存分析顯示Notch1、Hes1表達(dá)升高及VM陽性提示肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)。結(jié)論:VM的出現(xiàn)會提示肝癌術(shù)后的早期復(fù)發(fā),Notch1表達(dá)上調(diào)與肝癌EMT轉(zhuǎn)化及VM的形成存在相關(guān)性。第二部分Notch1對肝癌細(xì)胞體外血管擬態(tài)的影響目的:研究Notch1在肝癌細(xì)胞體外血管擬態(tài)中發(fā)揮的作用,探討其促進(jìn)肝癌細(xì)胞血管擬態(tài)的機制。方法:通過體外三維培養(yǎng)比較低侵襲人肝癌細(xì)胞HepG2和高侵襲人肝癌細(xì)胞MHCC97-H的小管形成能力,以RT-PCR及Western Blot比較兩種細(xì)胞的Notch1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平,確定實驗靶細(xì)胞。繼而以慢病毒載體表達(dá)技術(shù)實現(xiàn)HepG2細(xì)胞中Notch1過表達(dá),MHCC97-H 細(xì)胞中 Notch1消減表達(dá),獲得 HepG2/Notch1+及 MHCC97-H/Notch1-轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過三維培養(yǎng)比較轉(zhuǎn)化細(xì)胞的血管擬態(tài)能力;以熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞F-actin骨架蛋白,以RT-PCR及Weatern Blot檢測vimentin及E-cadherin的轉(zhuǎn)錄及表達(dá),觀察調(diào)控Notch1后肝癌細(xì)胞自身塑形的變化。最后,以TGF-β1誘導(dǎo),觀察Notch1表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞VM形成及EMT的關(guān)系。結(jié)果:低侵襲潛能的HepG2細(xì)胞Notch1表達(dá)水平低于高侵襲潛能的MHCC97-H細(xì)胞,不具備體外VM形成能力。在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)Notch1后細(xì)胞EMT潛能增加,獲得體外VM形成能力;TGF-β1可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生EMT,在此過程中Notch1表達(dá)水平升高并出現(xiàn)血管擬態(tài)。在高表達(dá)Notch1的MHCC97-H細(xì)胞中敲低Notch1,肝癌細(xì)胞EMT及VM形成潛能受抑,對TGF-β1誘導(dǎo)的EMT及VM形成反應(yīng)性降低。結(jié)論:Notch1的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT,進(jìn)而導(dǎo)致VM形成,下調(diào)Notch1可阻止肝癌細(xì)胞EMT,抑制肝癌細(xì)胞VM發(fā)育。第三部分Notch1在人肝癌裸鼠皮下移植瘤內(nèi)血管擬態(tài)中的作用目的:從整體水平探討Notch1與肝癌VM形成的關(guān)系。方法:應(yīng)用本研究第二部分構(gòu)建的轉(zhuǎn)化細(xì)胞HepG2/vector、HepG2/Notch1 +、MHCC97-H/vector、MHCC97-H/Notch1-細(xì)胞分別接種至裸鼠左前腋下,形成不同人肝癌細(xì)胞系的裸鼠皮下移植瘤模型。每隔2d測量移植瘤長短徑,繪制腫瘤生長曲線。造模后第28d活體熒光觀察皮下移植瘤生長情況。處死動物,剝?nèi)∫浦擦龇Q重。移植瘤組織病理學(xué)觀察;PAS-CD34雙染色及透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察移植瘤內(nèi)VM結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)染色法檢測移植瘤組織內(nèi)EMT標(biāo)志物vimentin及E-cadherin的表達(dá)。結(jié)果:HepG2/Notch1+移植瘤在造模后第20d生長加速,至實驗結(jié)束時移植瘤體積及瘤質(zhì)量均大于HepG2/vector;相反,MHCC97-H/Notch1-移植瘤在造模后第20d生長開始慢于MHCC97-H/vector,至實驗結(jié)束時瘤體積及質(zhì)量均小于MHCC97-H/vector。低表達(dá)Notch1的HepG2/vector和MHCC97-H/Notch1-移植瘤內(nèi)點、片狀壞死明顯,未觀察到典型的VM結(jié)構(gòu)。免疫組化染色顯示HepG2/Notch1+及MHCC97-H/vector移植瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞vimentin著色強度及著色比例高于HepG2/vector及MHCC97-H/Notch1-移植瘤;相應(yīng)的'E-cadherin的著色比例及強度在HepG2/Notch1+及MHCC97-H/vector移植瘤內(nèi)也較低。結(jié)論:Notch1可促進(jìn)人肝癌裸鼠皮下移植瘤中的VM形成,抑制Notch1表達(dá)可減少VM,抑制腫瘤生長。第四部分南蛇藤莖提取物調(diào)控Notch1抑制肝癌血管擬態(tài)目的:通過體外細(xì)胞實驗及體內(nèi)動物模型實驗,證實南蛇藤莖提取物(COE)下調(diào)Notch1表達(dá),抑制肝癌細(xì)胞EMT,減少VM形成,進(jìn)而抑制腫瘤生長。方法:體外實驗中,首先應(yīng)用CCK-8及活細(xì)胞工作站分析COE對MHCC97-H細(xì)胞增殖及匯合的抑制,在后續(xù)的實驗中選擇低于IC50的三組COE濃度(20、40、80μg/mL)進(jìn)行實驗,陽性對照藥物采用Notch1特異性阻斷劑DAPT(5μM)。應(yīng)用Transwell小室侵襲實驗分析COE對MHCC97-H細(xì)胞及TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的侵襲抑制;采用基質(zhì)膠小管形成實驗觀察COE對MHCC97-H細(xì)胞及TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞VM形成抑制。RT-PCR及Western Blot分析COE干預(yù)后兩種細(xì)胞Notch1、Hes1以及EMT標(biāo)記物vimentin、E-cadherin的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平;細(xì)胞骨架蛋白F-actin分布及表達(dá)采用熒光結(jié)合的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記。動物實驗中應(yīng)用GFP標(biāo)記的MHCC97-H細(xì)胞接種裸鼠皮下形成人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,造模成功后COE20、40、80mg/kg每天1次灌胃給藥,DAPT20mg/kg每天1次腹腔注射作為陽性對照,生理鹽水為空白對照。每隔2d測量移植瘤體積,繪制腫瘤生長曲線。第28d末次給藥后活體熒光觀察比較皮下移植瘤的熒光信號。剝?nèi)×鼋M織后稱重,切片病理觀察。PAS-CD34雙染色及TEM觀察各組血管擬態(tài)結(jié)構(gòu)。IHC檢測COE各濃度對移植瘤組織中Notch1、Hes1及EMT相關(guān)蛋白vimentin、E-cadherin表達(dá)的影響。結(jié)果:COE呈濃度及時間依賴性方式抑制MHCC97-H細(xì)胞的增殖,作用MHCC97-H細(xì)胞 24h 的 IC50 為 145.88μg/mL。COE 各濃度(20、40、80μg/mL)及 DAPT(5μM)處理細(xì)胞24h可有效抑制MHCC97-H及TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的侵襲及VM形成,COE80μg/mL濃度組作用接近DAPT效應(yīng)。Notch1及其下游靶基因Hes1在COE作用后轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平下降;細(xì)胞骨架重塑及vimentin表達(dá)在COE作用后受到抑制。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示COE可抑制MHCC97-H皮下移植瘤的生長,減少移植瘤內(nèi)擬態(tài)血管結(jié)構(gòu)。瘤組織內(nèi)Notch1、Hes1及vimentin表達(dá)水平在COE給藥各組及DAPT組均有明顯下降。結(jié)論:COE可抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生長,其機制與下調(diào)Notch1表達(dá),抑制肝癌EMT,減少VM形成有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R273

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1 張燕;鄭志z，

本文編號：1256862