本文關(guān)鍵詞：TREK1通道阻滯劑篩選及其抗抑郁機制的探討

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【摘要】：研究背景與目的：當(dāng)前的抗抑郁藥低有效率低已成為抑郁癥治療最突出的臨床難題之一。近年來基因工程鼠研究表明TREK1亞型雙孔鉀離子通道(TWIK-related mechano-gated two pore K+ channel)是抗抑郁治療的靶點,阻斷該通道與提高抗抑郁劑療效相關(guān)。而藥物基因組學(xué)研究也表明TREK1基因多態(tài)性與抗抑郁劑耐藥有關(guān)。然而目前尚缺乏理想的TREK1通道阻斷劑,阻斷TREK1通道發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機制也知之甚少。因此本課題擬篩選高效TREK1阻滯劑,評估其抗抑郁療效,并進(jìn)一步探討阻斷TREK1通道發(fā)揮抗抑郁樣作用的機制。方法： 1.通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建TREK1鉀通道重組質(zhì)粒TREK1-pCDNA3.1(+)/ pEGFP-Nl,并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞(Human embryonic kidney, HEK293),實現(xiàn)TREK1通道蛋白體外表達(dá)。2.利用鉈離子熒光高通量篩選法篩查中國科學(xué)院上海藥物所國家化合物庫,篩選可能阻斷TREK1通道的化合物；利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢驗篩選化合物對TREK1鉀通道的敏感性、特異性。3.利用表面等離子體共振(Surface plasmon resonance, SPR)技術(shù)測定篩選化合物與TREK1和五羥色胺1A受體(5-hydroxytryptamine receptor 1A,5-HTRia)親和力。4.通過藥代動力學(xué)實驗確定篩選化合物干預(yù)動物模型的有效劑量。5.通過慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)法建立抑郁癥動物模型,給予篩選的TREK1阻斷劑、文獻(xiàn)報道的TREK1阻斷劑spadin和抗抑郁劑西酞普蘭進(jìn)行干預(yù),利用強迫游泳實驗(Forced swimming test, FST)、開場實驗(Open field test, OFT)及蔗糖水偏好實驗(Sucrose preference test, SPT)評估篩選化合物的抗抑郁療效。6.通過場電位電生理實驗測量阻斷TREK1后抑郁模型大鼠中縫核(Dorsal raphie nuclei, DRN) 5-HT能神經(jīng)元、前額葉(Prefrontal cortex, PFC)錐體神經(jīng)元場電位的變化。7.利用免疫印跡及real-time PCR方法檢測阻斷TREK1通道后2周及4周抑郁模型大鼠DRN、 PFC及海馬CA1/CA3區(qū)蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)表達(dá)變化。8.利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測5-HTR1A激動劑和拮抗劑對表達(dá)在HEK293細(xì)胞膜上TREK1通道鉀電流的影響；在原代培養(yǎng)的孕17天胎鼠海馬神經(jīng)元中分別應(yīng)用篩選的TREK1阻斷劑和文獻(xiàn)報道的TREK1阻斷劑spadin,并同時給予5-HTR1A激動劑和拮抗劑干預(yù)24h,通過免疫印跡法觀察5-HTR1A功能對神經(jīng)元PKA、 CREB和BDNF信號分子表達(dá)的影響。結(jié)果：1.高通量篩選的化合物SID1900抑制TREK1通道熒光強度的IC50值為28.72+3.67μM,該化合物在0mV下阻斷TREK1通道鉀電流的ICso值為29.72+2.4μM,，且.對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元雙孔鉀離子通道(Two pore K+ channel, K2P)具有特異性阻斷作用(p0.001,1C50=87.09±4.2μM),對Na+、Ca2+和混合K+離子通道無顯著影響(p0.05)。2.SPR動力學(xué)數(shù)據(jù)顯示：不同濃度SID1900與TREK1鉀離子通道均具有較高親和力,平衡解離常數(shù)(KD)為1.905×10-10M。3.藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)表明：SID1900可通透大鼠血腦屏障(通透率78.74%)且生物利用度良好(78.03±9.65%),有效干預(yù)劑量為14.33 μM/kg。4.與CUMS應(yīng)激抑郁模型組相比,SID1900干預(yù)2周可顯著減少大鼠FST不動時間p0.001),療效早于西酞普蘭一周；另外在改善大鼠OFT水平活動、垂直活動評分及恢復(fù)蔗糖水偏好性方面,SID 1900也顯著優(yōu)于西酞普蘭(p=0.001,p＜0.001, p=0.031),與spadin一致。5.場電位電生理實驗結(jié)果表明：用SID 1900 (14.33 μM/kg, i.p.)干預(yù)4周后,應(yīng)激抑郁大鼠DRN區(qū)5-HT能神經(jīng)元和PFC區(qū)錐體神經(jīng)元電沖動發(fā)放率(Firing rate)分別為：(4.35+0.61)Hz和(5.02±0.82)Hz,與模型組相比顯著增加(p=0.014,p=0.003),明顯高于西酞普蘭(p0.05),與spadin干預(yù)結(jié)果一致。另外SID 1900、spadin和西酞普蘭分別于給藥6min、 7min40s和9min40s后顯著增加CUMS模型大鼠DRN區(qū)5-HT能神經(jīng)元firing rate。 6. real-time PCR和免疫印跡檢測結(jié)果表明：SID1900干預(yù)CUMS模型大鼠2周可顯著上調(diào)中縫核、海馬CA1/CA3和PFC區(qū)PKA、 CREB和BDNF mRNA及BDNF蛋白表達(dá)(與模型組相比p0.001),這與spadin干預(yù)2周和西酞普蘭干預(yù)4周的結(jié)果接近。7.在0mV下30μM5-HTR1A激動劑8-OH-DPAT可增強19.14±1.34% TREK1通道鉀電流,而10μM5-HTR1A拮抗劑WAY 100635可阻斷17.18±1.26% TREK1鉀電流；在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中同時應(yīng)用8-OH-DPAT和SID1900較單獨應(yīng)用SID1900對上調(diào)PKA-CREB-BDNF表達(dá)效果更顯著(p0.05),而同時給予WAY100635和SID1900與單獨應(yīng)用SID1900相比,PKA-CREB-BDNF表達(dá)顯著降低(p0.05)。另外,SPR數(shù)據(jù)顯示：不同濃度SID1900與5-HT1A受體均具有較低親和力,平衡解離常數(shù)(KD)為2.597×10-4M。結(jié)論 1.本研究篩選的化合物SID1900可有效阻斷TREK1通道,對雙孔鉀離子通道具有較高特異性； 2.SID1900可順利通透血腦屏障且生物利用度良好,干預(yù)應(yīng)激抑郁大鼠模型可產(chǎn)生顯著抗抑郁樣反應(yīng)；3.5-HTR1A在阻斷神經(jīng)元TREK1通道后上調(diào)PKA-CREB-BDNF表達(dá)過程中可能發(fā)揮重要的協(xié)同作用；4.SID1900發(fā)揮抗抑郁樣效應(yīng)可能與阻斷TREK1通道后增強5-HT傳遞、5-HTR1A協(xié)同效應(yīng)及中縫核、PFC和海馬CA1/CA3區(qū)PKA-CREB-BDNF信號表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.4

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本文編號：1254723