本文關(guān)鍵詞：Notch、VEGF-A、Ang-1信號通路在非血管化輸送盤牽張成骨中調(diào)控血管新生的機(jī)制研究

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【摘要】：目的骨是高度血管化的組織,骨新生依賴良好的血供和營養(yǎng)支持,血管和骨細(xì)胞之間緊密的時空聯(lián)系維持了骨骼的完整性。因此,在骨骼發(fā)展和骨折修復(fù)期間,血管形成起著相當(dāng)重要的作用。同樣,在傳統(tǒng)輸送盤牽張成骨過程中要求各骨段上要有充足的血液供應(yīng),以保證牽張過程中旺盛的代謝活動、超常的營養(yǎng)供應(yīng)及各骨段組織的正常代謝。本課題基于一次應(yīng)用傳統(tǒng)的輸送盤牽張成骨技術(shù)修復(fù)大范圍頜骨缺損的臨床實(shí)踐中,意外發(fā)現(xiàn)完全剝離骨膜、無軟組織附著的骨游離輸送盤依然可以成功修復(fù)頜骨缺損的基礎(chǔ)上,課題組負(fù)責(zé)人提出了“非血管化游離輸送盤牽張成骨(Nonvascular Transport Distraction Osteogenesis,NTDO)”。之后課題組通過動物實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了“下頜骨非血管化骨游離輸送盤牽張成骨”的動物模型,證實(shí)了剝離骨膜而失去血供的游離骨輸送盤依然能在牽張引力作用下成骨。NTDO模式的提出打破了傳統(tǒng)輸送盤牽張成骨模式中必須強(qiáng)調(diào)術(shù)中要盡可能保存骨輸送盤的骨膜和周圍軟組織附著來為輸送盤提供充足血供的原則,NTDO為那些周圍組織血供不足或由于巨大骨缺損而無法在骨斷端制作保留骨膜和軟組織附著的合適骨輸送盤的患者提供了新的治療方法。然而NTDO過程中血管新生的確切機(jī)制以及血管新生和新骨生成的時空耦聯(lián)尚不明了,闡明NTDO過程中血管新生的機(jī)制,探索影響血管新生的細(xì)胞和分子機(jī)制,可以為NTDO提供理論依據(jù),有助于指導(dǎo)臨床更好地應(yīng)用該技術(shù)。本研究應(yīng)用血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)作為種子細(xì)胞,擬通過激活EPCs內(nèi)的Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,研究Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在牽張區(qū)新生血管的系列分子調(diào)控事件,進(jìn)一步闡明“非血管化游離輸送盤牽張成骨”模式中的新生血管形成機(jī)制,為“非血管化游離輸送盤牽張成骨”提供理論依據(jù)。“非血管化游離輸送盤牽張成骨”技術(shù)將為臨床廣泛應(yīng)用非血管化輸送盤牽張成骨技術(shù)修復(fù)巨大骨缺損尤其是在無法實(shí)施傳統(tǒng)的輸送盤治療整復(fù)的腫瘤術(shù)后重建及顱頜面整形等領(lǐng)域提供一種新的具有應(yīng)用前景的治療方法。方法1.犬內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)體外分離培養(yǎng)及鑒定的實(shí)驗(yàn)研究:取健康雜種犬,年齡1~2歲,于雙側(cè)脛骨穿刺抽取脛骨骨髓20ml,采用密度梯度離心法結(jié)合特殊誘導(dǎo)培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)犬骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞;通過倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物;通過免疫熒光雙重染色鑒定及VEGFR-2與v WF免疫組化鑒定犬骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞;通過Matrigel小管形成實(shí)驗(yàn)檢測犬內(nèi)皮祖細(xì)胞血管形成的能力。2.慢病毒介導(dǎo)的h Notch1.ICN轉(zhuǎn)染犬EPCs的實(shí)驗(yàn)研究:構(gòu)建Notch1.ICN慢病毒表達(dá)載體,測定病毒滴度,檢測質(zhì)粒表達(dá)情況;之后取犬第2代或者第3代EPCs,用慢病毒作為載體介導(dǎo)h Notch1.ICN基因轉(zhuǎn)染入犬EPCs中,測定感染細(xì)胞最佳MOI;采用QPCR法和Western blot法檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后h Notch1.ICN在EPCs的表達(dá)情況。3.過表達(dá)h Notch1.ICN對EPCs生物學(xué)行為的影響:采用CCK-8法檢測過表達(dá)h Notch1.ICN對EPCs生長活力的影響;Annexin V/PI法檢測過表達(dá)h Notch1.ICN對EPCs凋亡的影響;流式細(xì)胞儀檢測過表達(dá)h Notch1.ICN對EPCs周期的影響;Transwell小室考察過表達(dá)h Notch1.ICN后EPCs跨內(nèi)皮遷移的能力及對EPCs遷移粘附能力和血管形成能力的影響;QPCR法和Western blot法檢測慢病毒轉(zhuǎn)染EPCs后,Notch信號下游信號分子Hes 1和Hey 1的m RNA和蛋白表達(dá)情況。4.Notch信號通路促進(jìn)非血管化輸送盤牽張成骨血管新生的實(shí)驗(yàn)研究:取健康雜種犬27只隨機(jī)分為3組,每組9只。A組:實(shí)驗(yàn)組(注射h Notch1.ICN基因轉(zhuǎn)染的自體EPCs);B組:對照組(注射自體EPCs);C組:空白組(注射生理鹽水)。建立犬下頜骨非血管化輸送盤牽張動物模型,制作非血管化輸送盤并安裝牽張器。于牽張固定期1周、2周、4周后,各組分別處死相應(yīng)動物并取材,通過大體觀察、X線片觀察新骨形成和改建情況;通過HE染色觀察牽張區(qū)新生血管的結(jié)構(gòu);通過CD105免疫組織化學(xué)和Chalkley法來進(jìn)行血管生成數(shù)量的定量檢測;通過實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(q PCR)、Western blot法檢測牽張區(qū)血管生成因子VEGF-1和Ang-1 m RNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1.犬內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)體外分離培養(yǎng)及鑒定的實(shí)驗(yàn)研究:原代培養(yǎng)5d后EPCs,鏡下可見貼壁細(xì)胞體積開始增大,細(xì)胞呈集落式生長,細(xì)胞形態(tài)呈長條狀、梭形或多角形,部分細(xì)胞形成集落,中心為多角形細(xì)胞,四周長梭形細(xì)胞呈放射狀排列。培養(yǎng)至7-10d時傳代后細(xì)胞生長、增殖速度較快,成群細(xì)胞呈典型的“鋪路石”或“鵝卵石”樣排列;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:CD34與CD133呈陽性表達(dá);v WF與VEGFR-2免疫組化兩者均呈陽性;免疫熒光雙重染色結(jié)果顯示EPCs既能攝取Di I-ac LDL又能與FITC-UEA-1結(jié)合是EPCs具有的典型內(nèi)皮特征,提示該陽性細(xì)胞為正在向內(nèi)皮細(xì)胞分化的EPCs;Matrigel小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EPCs具有形成新生血管的能力。2.慢病毒介導(dǎo)的h Notch1.ICN轉(zhuǎn)染犬EPCs的實(shí)驗(yàn)研究:成功構(gòu)建了Notch1.ICN慢病毒表達(dá)載體,犬內(nèi)皮祖細(xì)胞感染慢病毒MOI值為10-20;通過Western Blot檢測,h Notch l.ICN過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒在293TN細(xì)胞中有表達(dá),病毒的平均滴度為1.02E+08 IU ml-1;QPCR法檢測到慢病毒轉(zhuǎn)染后h Notch1.ICN m RNA有明顯過表達(dá);通過Western Blot檢測,h Notch l.ICN在EPCs中有明顯過表達(dá)。3.過表達(dá)h Notch1.ICN對EPCs生物學(xué)行為的影響:CCK-8法檢測過表達(dá)h Notch1.ICN基因?qū)PCs的生存活力沒有顯著影響(p㧐0.05);Annexin V/PI法檢測過表達(dá)h Notch1.ICN基因可增強(qiáng)EPCs抗凋亡能力(p0.05);流式細(xì)胞儀檢測在EPCs過表達(dá)h Notch1.ICN基因使處于G2期的EPCs細(xì)胞增多(p0.05);過表達(dá)h Notch1.ICN基因促進(jìn)了EPCs與活化內(nèi)皮細(xì)胞粘附,促進(jìn)EPCs跨內(nèi)皮遷移,促進(jìn)EPCs管樣結(jié)構(gòu)形成(p0.05)。q PCR和Western blot法檢測慢病毒轉(zhuǎn)染EPCs后結(jié)果顯示,Notch信號下游信號分子Hes 1和Hey 1的m RNA(p0.05)和蛋白表達(dá)均增加。4.Notch信號通路促進(jìn)非血管化輸送盤牽張成骨血管新生的機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究:所有動物均順利完成牽張,無感染,動物全部存活至取材時間,無死亡。實(shí)驗(yàn)動物的體重均有不同程度增加。放置于下頜部的牽張器均固定良好,無牽張區(qū)、牽張器斷裂以及松脫現(xiàn)象。通過標(biāo)本的大體病理、HE染色組織切片、X線,顯示牽張區(qū)新骨均愈合良好,新骨形成質(zhì)量由高到低:A組B組C組。通過Chalkley法定量檢測新生血管的數(shù)量,在固定期1周、2周、4周,三組新生血管數(shù)量隨著時間推移呈梯度遞減趨勢,新生血管數(shù)量A組到C組逐漸減少,各組經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析均有差異(p0.05)。q PCR法檢測Ang-1,在各時間點(diǎn)A組均顯著高于B、C組(p0.01);固定1周時,A組VEGF-A顯著高于B組(p0.01),2、4周時與B組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),A組均顯著高于C組(p0.01)。Western blot法檢測VEGF-A、Ang-1蛋白表達(dá)A組B組C組,但隨固定時間的延長,表達(dá)逐漸降低。結(jié)論1.過表達(dá)h Notch 1.ICN促進(jìn)了Notch信號下游效應(yīng)分子Hes 1、Hey1基因及蛋白的表達(dá);持續(xù)活化的Notch 1信號不影響犬EPCs存活,但使細(xì)胞周期阻滯于G2期,延緩了細(xì)胞周期的進(jìn)展,使其不進(jìn)入下一輪細(xì)胞周期,抑制了EPCs的分化;增強(qiáng)了犬EPCs的抗凋亡能力。2.Notch 1.ICN過表達(dá)能夠促進(jìn)EPCs與活化內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、跨內(nèi)皮遷移以及管腔樣結(jié)構(gòu)的形成。3.證實(shí)了Notch 1.ICN基因治療是通過Notch信號上調(diào)血管生成因子VEGF-A與Ang-1的表達(dá)來促進(jìn)非血管化輸送盤牽張區(qū)血管的新生。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R782.4

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1 張麗;夏德雨;李國輝;蔣姍姍;谷芳娜;梁英民;;Notch信號在急性早幼粒細(xì)胞白血病患者骨髓中的表達(dá)[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2009年24期

2 姜萌;何奔;;Notch信號對血管新生調(diào)控作用的研究進(jìn)展[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2010年05期

3 ;Effect of Trastuzumab on Notch-1 Signaling Pathway in Breast Cancer SK-BR3 Cells[J];Chinese Journal of Cancer Research;2012年03期

4 魯茁壯,王立生,吳祖澤;Notch信號通路研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2004年02期

5 張謙慎;Notch信號與肺發(fā)育[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2004年02期

6 孫力,詹啟敏,章文華;Notch信號通路與腫瘤[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);2004年09期

7 張謙慎,常立文,劉漢楚,容志惠,祝華平,陳紅兵,李文斌;Notch信號與大鼠肺發(fā)育的關(guān)系研究[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2004年03期

8 張謙慎,常立文,劉漢楚,容志惠,陳紅兵;TEMPORAL EXPRESSION OF NOTCH RECEPTORS DURING LUNG DEVELOPMENT IN RAT[J];Journal of Shanghai Second Medical University;2005年02期

9 吳穎亞;王季石;;Notch及其配體在血液系統(tǒng)中的作用[J];國外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊;2005年05期

10 張謙慎,常立文,劉漢楚,容志惠,陳紅兵;Relationship between Notch Receptors and Hyperoxia-induced Lung Injury in Newborn Rats[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)英德文版);2005年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張麗;梁英民;夏德雨;李國輝;蔣姍姍;谷芳娜;;Notch信號在急性早幼粒細(xì)胞白血病患者骨髓中的表達(dá)研究[A];第12屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會議論文摘要[C];2009年

2 ;Expression profile of Notch-related genes in multi-drug resistant K562/A02 cells compared with parental K562 cells[A];第12屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會議論文摘要[C];2009年

3 ;Notch signaling in lymphopoiesis[A];第10屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2005年

4 韓驊;;Notch信號途徑的功能和作用機(jī)理的研究[A];全面建設(shè)小康社會：中國科技工作者的歷史責(zé)任——中國科協(xié)2003年學(xué)術(shù)年會論文集（下）[C];2003年

5 趙昱;侯麗宏;馬磊;朱正華;朱蕭玲;王強(qiáng);呂巖;陳紹洋;;Electroacupuncture pretreatment induces the tolerance against focal cerebral ischemia through activation of Notch pathway[A];中華醫(yī)學(xué)會第五次全國重癥醫(yī)學(xué)大會論文匯編[C];2011年

6 黃佳圓;王銳;陳龍邦;;Expression of Notch-1 and Its Clinical Significance in Different Histological Subtypes of Human Lung Adenocarcinoma[A];2013華東胸部腫瘤論壇暨第六屆浙江省胸部腫瘤論壇論文集[C];2013年

7 ;Aberrant expression profile of Notch signaling pathway involved in immune thrombocytopenic purpura patients[A];第12屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會議論文摘要[C];2009年

8 ;Notch induced protein degradation in lymphoid development[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

9 ;The functions of ptrl in Notch and Integrin pathways[A];2012全國發(fā)育生物學(xué)大會摘要集[C];2012年

10 Yaochun Wang;Guorui Dou;Lin Wang;Hua Han;;Notch signaling:licenses and limits cellular responses to extrinsic stimulations?[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第十屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議摘要集[C];2010年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;為什么心在左肝在右？[N];新華每日電訊;2004年

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1 王凱;Notch信號在小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)元死亡中的作用及機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 陳娟娟;Notch重組配體D1R在促進(jìn)造血重建中的作用與機(jī)理[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 梁燕;Notch3對低氧誘導(dǎo)的人肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制探討[D];首都醫(yī)科大學(xué);2014年

4 孫建華;肺癌患者在乏氧條件下VEGF和Dll4/Notch通路分子的異常表達(dá)和相互關(guān)系[D];山東大學(xué);2015年

5 丁君;缺氧誘導(dǎo)因子1-α和Notch1的關(guān)系及其在阿爾茨海默病中的研究[D];華中科技大學(xué);2015年

6 付偉;Notch信號在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖和伊馬替尼耐藥的調(diào)控作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

7 柏振江;Notch配體DLL4在手足口病患兒中表達(dá)、臨床意義和功能分析[D];蘇州大學(xué);2016年

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