本文關(guān)鍵詞：HMGB1及其抑制劑甘草酸苷在創(chuàng)傷性胰腺炎中的作用與機(jī)制研究

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【摘要】：研究目的:雖然胰腺創(chuàng)傷比較罕見,其發(fā)生只占創(chuàng)傷患者的2%~5%,占閉合性腹部創(chuàng)傷的5%和腹部穿通傷的2%~6%。但是由于其常常難以察覺和治療棘手,因而有較高的并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率。由于胰腺創(chuàng)傷的早期癥狀及體征不明顯,經(jīng)常直到創(chuàng)傷所致的急性胰腺炎出現(xiàn)才引起注意。創(chuàng)傷導(dǎo)致的急性胰腺炎也被稱之為創(chuàng)傷性胰腺炎(TP),其經(jīng)常伴隨一些嚴(yán)重的并發(fā)癥,如全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、休克、多器官功能衰竭(MOF)等等。盡管其它原因所致的急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制和治療效果已經(jīng)有了廣泛的研究,但是很少有學(xué)者關(guān)注創(chuàng)傷所致的急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制及治療。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是核內(nèi)高度保守的非組蛋白染色體蛋白,其主要穩(wěn)定核小體的結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。HMGB1可以主動或被動從細(xì)胞中釋放并在各種疾病中起重要作用,且與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此,HMGB1被認(rèn)為可能是抗炎治療的一個靶點(diǎn),HMGB1的抑制劑也成為治療這些疾病的潛在的新的治療策略。然而,HMGB1與TP之間的關(guān)系還沒有相關(guān)的研究,HMGB1的抑制劑在TP的治療上也未見報(bào)道。最近,甘草酸苷(GL)被確認(rèn)為是HMGB1的抑制劑,其直接結(jié)合HMGB1并抑制其細(xì)胞因子活性。GL是甘草的主要活性成分,通常用于治療慢性肝炎患者。該化合物與許多藥理作用相關(guān),包括抗炎,抗病毒,抗腫瘤和保肝。然而,GL在治療TP中的作用及機(jī)制還未曾有過研究。我們已經(jīng)研發(fā)了一個單純的創(chuàng)傷性胰腺炎大鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?并已在創(chuàng)傷性胰腺炎的機(jī)制和治療方法上做了一些研究。因此,我們將研究HMGB1在TP中的作用以及其抑制劑GL治療TP的效果及機(jī)制。方法:第一部分:HMGB1在大鼠創(chuàng)傷性胰腺炎中的作用將48只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組(每組8只),分別是①假手術(shù)對照組(control組),②創(chuàng)傷性胰腺炎6h組(TP 6h組),③TP 12h組,④TP 24h組,⑤TP 48h組,⑥tp72h組。tp大鼠模型的制備采用bim-Ⅲ型生物撞擊機(jī)產(chǎn)生的一個恒定的400kpa壓力的壓縮空氣來沖擊大鼠胰腺體部固定區(qū)域。在相應(yīng)的時相點(diǎn),人性化處死大鼠后,再取血及胰腺標(biāo)本用于檢測以下指標(biāo):血清淀粉酶,血清hmgb1及tnf-α,胰腺組織大體病理變化、組織光鏡下病理變化及病理評分,胰腺組織hmgb1免疫組化分析,westernblot檢測胰腺組織hmgb1蛋白的表達(dá),胰腺病理評分與hmgb1表達(dá)的相關(guān)性。第二部分:hmgb1抑制劑甘草酸苷在大鼠創(chuàng)傷性胰腺炎中的保護(hù)作用將60只wistar大鼠隨機(jī)分為3組(每組20只),分別是①假手術(shù)對照組(control組),②創(chuàng)傷性胰腺炎24h組(tp組),③創(chuàng)傷性胰腺炎甘草酸苷治療組(tp-gl組)。另外,再增加60只大鼠按照上述分組和處理辦法,用于檢測各組大鼠的7d的生存率。tp大鼠模型的制備采用第一部分的方法。在相應(yīng)處理后24h人性化處死大鼠,再取血及胰腺標(biāo)本用于檢測以下指標(biāo):血清淀粉酶,血清hmgb1、tnf-α和il-6,胰腺組織大體病理變化、光鏡下組織病理變化及病理評分,tunel法檢測胰腺細(xì)胞凋亡及計(jì)算凋亡指數(shù),westernblot檢測胰腺組織caspase3蛋白的表達(dá),胰腺組織超氧化物歧化酶(sod)及丙二醛(mda)活性檢測。第三部分:hmgb1抑制劑甘草酸苷在大鼠創(chuàng)傷性胰腺炎中的作用途徑及分子機(jī)制將60只wistar大鼠隨機(jī)分為3組(每組20只),分別是①假手術(shù)對照組(control組),②創(chuàng)傷性胰腺炎24h組(tp組),③創(chuàng)傷性胰腺炎甘草酸苷治療組(tp-gl組)。tp大鼠模型的制備采用第一部分的方法。在相應(yīng)處理后24h人性化處死大鼠,再取血及胰腺標(biāo)本用于檢測以下指標(biāo):胰腺組織hmgb1、tlr4、nf-κb免疫組化分析,westernblot檢測胰腺組織hmgb1、tlr4蛋白的表達(dá),real timepcr檢測胰腺組織hmgb1、tlr4mrna,emsa法檢測胰腺組織nf-κb,elisa法檢測胰腺組織tnf-α及il-6,胰腺組織中hmgb1與tlr4、nf-κb之間的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果:第一部分:hmgb1在大鼠創(chuàng)傷性胰腺炎中的作用1.tp大鼠血清淀粉酶從制模后6h開始明顯增加,到12h時進(jìn)一步上升,直到24h達(dá)到高峰值,隨后于48h開始下降,到72h時降至control組基線水平。2.tp大鼠血清tnf-α從制模后6h開始明顯增加,12h達(dá)到峰值,24h開始下降,48h、72h均降至基線水平。而tp大鼠血清hmgb1從制模后6h開始上升,12h明顯升高,隨后于24h達(dá)到頂峰,48h、72h均下降。3.tp大鼠各時相點(diǎn)胰腺大體病理、胰腺組織學(xué)觀察及病理評分情況表明:胰腺組織損傷在制模后6h開始明顯升高,12h繼續(xù)升高,24h達(dá)到峰值,隨后在48h開始下降,72h繼續(xù)下降。4.tp大鼠各時相點(diǎn)胰腺組織hmgb1免疫組化及westernblot檢測情況表明:hmgb1在制模后6h開始上升,12h明顯增高,24h達(dá)到峰值,48h、72h出現(xiàn)下降。5.tp大鼠血及胰腺組織中hmgb1與胰腺組織病理評分具有正相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為r=0.841及r=0.83。第二部分:hmgb1抑制劑甘草酸苷在大鼠創(chuàng)傷性胰腺炎中的保護(hù)作用1.kaplan-meier生存曲線顯示tp-gl組7天生存率明顯高于tp組(65%versus45%),表明gl可能改善了tp大鼠的生存率。2.tp組和tp-gl組血清淀粉酶水平均高于control組,tp-gl組血清淀粉酶水平輕度低于tp組,但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明gl不具有胰酶抑制作用。3.tp組和tp-gl組血清tnf-α、il-6和hmgb1水平均顯著高于control組。然而,與tp組相比,三種促炎細(xì)胞因子在tp-gl組都顯示出了明顯的降低,表明gl能抑制早期及晚期炎癥介質(zhì)。4.tp組和tp-gl組的胰腺組織病理損傷顯著高于control組,但是tp-gl組的情況好于tp組,表明gl能改善tp大鼠的胰腺病理損害。5.tp組和tp-gl組凋亡水平顯著高于control組,但tp-gl組凋亡水平顯著低于tp組,表明gl能抑制tp大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。6.tp組及tp-gl組sod水平比control組明顯降低,但tp-gl組的sod水平較tp組顯著升高;而tp組胰腺組織mda水平組顯著升高,tp-gl組的mda水平較tp組有明顯的降低,表明gl能改善tp大鼠胰腺的氧化應(yīng)激狀況。第三部分:hmgb1抑制劑甘草酸苷在大鼠創(chuàng)傷性胰腺炎中的作用途徑及分子機(jī)制1.tp組大鼠胰腺組織中hmgb1的表達(dá)明顯增加,而tp-gl組明顯減少。表明gl能抑制tp大鼠胰腺組織中hmgb1的表達(dá)。2.tp組大鼠胰腺組織中tlr4的表達(dá)明顯增加,而tp-gl組明顯減少。表明gl能抑制tp大鼠胰腺組織中tlr4的表達(dá)。3.tp組大鼠胰腺組織中nf-κb的水平明顯增加,而tp-gl組明顯減少。表明gl能抑制tp大鼠胰腺組織中的nf-κb。4.tp組大鼠胰腺組織中tnf-α及il-6水平顯著增加,而tp-gl組顯著降低,表明表明GL能抑制TP大鼠胰腺組織中的TNF-α及IL-6。5.TP大鼠胰腺組織HMGB1的表達(dá)與TLR4、NF-κB的表達(dá)均具有正相關(guān)關(guān)系,提示GL對TP大鼠的保護(hù)作用可能是通過抑制HMGB1-TLR4-NF-κB通路起作用。結(jié)論:TP大鼠血清及胰腺組織中HMGB1明顯增加,并且與TP大鼠胰腺病理評分呈正相關(guān)性,HMGB1的水平可以作為評估TP嚴(yán)重性的一項(xiàng)重要觀察指標(biāo)。而GL治療TP大鼠后,提高了7天生存率,降低了血清早期及晚期炎癥介質(zhì),改善了胰腺組織病理損傷,降低了胰腺組織的凋亡水平,改善了胰腺組織的氧化應(yīng)激狀況。TP導(dǎo)致了大鼠胰腺組織中HMGB1-TLR4-NF-κB通路激活及炎癥因子水平升高,而GL能抑制該通路激活并降低炎癥因子水平。因此,我們的研究表明GL對TP大鼠胰腺組織具有保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：高遷移率族蛋白1 創(chuàng)傷性胰腺炎 甘草酸苷 細(xì)胞因子 細(xì)胞凋亡 氧化應(yīng)激 Toll樣受體4 核因子-κB
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R657.51
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-11
• 摘要11-15
• 第一章 前言15-18
• 第二章 HMGB1在大鼠創(chuàng)傷性胰腺炎中的作用18-39
• 2.1 材料和實(shí)驗(yàn)方法18-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-34
• 2.3 討論34-37
• 2.4 小結(jié)37-39
• 第三章 HMGB1抑制劑甘草酸苷在大鼠創(chuàng)傷性胰腺炎中的保護(hù)作用39-58
• 3.1 材料和實(shí)驗(yàn)方法40-47
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-55
• 3.3 討論55-56
• 3.4 小結(jié)56-58
• 第四章 HMGB1抑制劑甘草酸苷在大鼠創(chuàng)傷性胰腺炎中的作用途徑及分子機(jī)制58-75
• 4.1 材料和實(shí)驗(yàn)方法58-66
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-71
• 4.3 討論71-73
• 4.4 小結(jié)73-75
• 全文總結(jié)75-76
• 參考文獻(xiàn)76-82
• 文獻(xiàn)綜述82-102
• 參考文獻(xiàn)93-102
• 攻讀博士期間發(fā)表的論文102
• 攻讀博士期間獲得的專利102-103
• 致謝103-104

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1133677