本文關(guān)鍵詞：白念珠菌甘露多糖疫苗評價及白念珠菌侵入人內(nèi)皮和上皮細胞動態(tài)觀察

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【摘要】：白念珠菌是一種多邊芽殖酵母菌,它是造成免疫缺陷人群醫(yī)源性感染最主要的病原體之一。一般情況下,它是人類常見的寄生菌,可存在于口咽、胃腸道和陰道粘膜表面。正常情況下,它并不引起人類疾病。但是,當宿主局部微環(huán)境失調(diào)或粘膜屏障受損時,白念珠菌可造成粘膜感染,引起鵝口瘡、霉菌性陰道炎、間擦疹等疾病。甚至在某些情況下,白念珠菌還可侵入粘膜上皮和血管內(nèi)皮引起易感人群血行播散性感染。在引起上述疾病的過程中,白念珠菌與宿主細胞的相互作用貫穿始終。白念珠菌細胞壁是直接與宿主細胞接觸的部分,含有大量可被機體識別的抗原。該菌細胞壁80-90%由糖類組成。細胞壁的最外層是甘露聚糖與胞壁蛋白共價結(jié)合而成的糖肽結(jié)構(gòu)。既往研究發(fā)現(xiàn),白念珠菌胞壁糖蛋白結(jié)構(gòu)包含以α1,6鍵形成的甘露糖骨架和部分磷酸化的β-1,2鍵甘露聚糖為主的側(cè)鏈。當用念珠菌胞壁甘露聚糖抗原復合物免疫小鼠后,可顯著延長白念珠菌播散性感染模型小鼠的生存時間。但是,甘露聚糖為T細胞非依賴性2型抗原,缺乏有效的免疫原性,不能誘導機體產(chǎn)生足夠的抗體。為了研發(fā)有效的抗真菌甘露聚糖疫苗,我們合成了鑰孔血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)與β-甘露二糖、三糖和四糖偶聯(lián)形成的糖肽化合物。同時,通過軟件設計,我們還從白念珠菌毒力蛋白Als1中截取特異性表位短肽,并將其與糖肽疫苗偶聯(lián),從而提供額外的抗原表位。Als1是白念珠菌胞壁蛋白,可以介導白念珠菌與血管內(nèi)皮細胞粘附。我們將上述糖肽化合物以聯(lián)合佐劑或不聯(lián)合佐劑的形式免疫小鼠,末次免疫2周后采取小鼠血清,評價人工合成糖肽化合物的免疫原性和免疫反應性。研究發(fā)現(xiàn),與KLH偶聯(lián)的甘露聚糖糖肽疫苗可以刺激小鼠產(chǎn)生針對相應多糖的特異性抗體和針對Als1短肽的抗體。更有趣的是,與KLH偶聯(lián)的甘露聚糖糖肽化合物可以在無佐劑的情況下使小鼠產(chǎn)生相應特異性抗體。但是,相比于甘露三糖和甘露二糖,甘露四糖糖肽疫苗并不能產(chǎn)生更高的抗體滴度。甘露三糖免疫的小鼠血清中的抗體可以識別白念珠菌的酵母和菌絲。同時,甘露三糖誘導產(chǎn)生的抗體還可識別熱帶念珠菌、光滑念珠菌和葡萄牙念珠菌四種臨床常見的念珠菌,而甘露四糖和甘露二糖糖肽復合物刺激產(chǎn)生的抗體并不能識別這些念珠菌。除了β-(Man)3-KLH不聯(lián)合佐劑的情況下可以對白念珠菌播散性感染模型產(chǎn)生保護性,其他疫苗聯(lián)合/不聯(lián)合佐劑并不能延長播散性念珠菌感染的小鼠生存時間。該實驗說明只有甘露三糖糖肽疫苗產(chǎn)生的抗體可以識別并保護白念珠菌所致的感染,甘露聚糖糖鏈過長或過短都不能產(chǎn)生正確識別白念珠菌的抗體。白念珠菌侵入宿主非吞噬細胞,如上皮細胞和內(nèi)皮細胞,在致病初期起至關(guān)重要的作用。目前尚缺乏白念珠菌與上述宿主細胞的動態(tài)觀察研究。我們采用活細胞實時觀測方法捕捉到白念珠菌與宿主細胞早期的相互作用過程。觀察到宿主細胞偽足形成在介導內(nèi)吞白念珠菌過程中起重要作用,依賴于白念珠菌菌絲特異蛋白Als3和宿主細胞骨架actin;而主動入侵則依賴白念珠菌菌絲生長。同時,我們觀察了介導內(nèi)吞和主動入侵在白念珠菌進入臨床常見的2種人上皮細胞(OKF6/Tert2和FaDu)和2種人內(nèi)皮細胞(HUVECs和TIME)的異同。介導內(nèi)吞在白念珠菌進入FaDu細胞過程中起重要作用,但在其進入OKF6/Tert2上皮細胞過程中,兩種途徑均發(fā)揮重要作用。白念珠菌與]HUVECs內(nèi)皮細胞相互作用早期,主要依靠介導內(nèi)吞方式進入細胞,而在后期則以主要以主動入侵方式進入內(nèi)皮細胞。白念珠菌進入TIME內(nèi)皮細胞則主要依靠介導內(nèi)吞作用。進入方式的差別可能與同種細胞不同細胞系的膜表面受體分布、信號通路以及細胞骨架(肌動蛋白和微管)有關(guān)。最后,我們還比較了白念珠菌毒力蛋白和宿主細胞因子在白念珠菌介導內(nèi)吞和主動入侵過程中所發(fā)揮的作用。
【關(guān)鍵詞】：白念珠菌 多糖 甘露聚糖 抗體 表皮細胞 上皮細胞
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-13
• 前言13-20
• 一、課題背景介紹13-18
• 二、本研究的內(nèi)容和意義18-20
• 第一部分：人工合成甘露聚糖糖肽疫苗免疫原性和免疫反應性測定20-39
• 一、引言20-21
• 二、材料與方法21-28
• 三、實驗結(jié)果28-36
• 四、討論36-39
• 第二部分：白念珠菌侵入內(nèi)皮細胞與上皮細胞動態(tài)觀察39-60
• 一、引言39-40
• 二、材料與方法40-50
• 三、實驗結(jié)果50-58
• 四、討論58-60
• 第三部分：白念珠菌侵入內(nèi)皮細胞與上皮細胞的機制初探60-77
• 一、引言60
• 二、材料與方法60-63
• 三、實驗方法63-66
• 四、實驗結(jié)果66-74
• 五、討論74-77
• 全文小結(jié)77-79
• 參考文獻79-84
• 文獻綜述84-93
• 參考文獻90-93
• 在讀期間發(fā)表論文與科研工作說明93-94
• 致謝94

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本文編號：1117219