本文關(guān)鍵詞：Nrf2對(duì)缺氧預(yù)處理內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管作用的影響及相關(guān)機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景與目的動(dòng)脈粥樣硬化所致的缺血性疾病(包括缺血性心臟病、缺血性腦卒中和外周動(dòng)脈疾病等)嚴(yán)重危害中老年人的健康。盡管藥物治療和介入治療取得了巨大進(jìn)展,但對(duì)于急性心肌梗死和冠心病三支血管病變不適合冠脈介入治療患者,促進(jìn)缺血心肌血管生成,改善心肌供血,對(duì)于緩解臨床癥狀、提高心功能和改善預(yù)后具有重要意義。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,具有血管生成的先天優(yōu)勢(shì),因此,通過促進(jìn)EPCs血管生成和改善組織供血而被廣泛用于細(xì)胞移植治療缺血性心臟病和外周動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的研究。然而,由于這些組織多存在嚴(yán)重的缺血缺氧的微環(huán)境,不利于細(xì)胞生存和發(fā)揮作用,致使大部分移植細(xì)胞發(fā)生凋亡或死亡。因此,如何調(diào)節(jié)和促進(jìn)移植的EPCs在缺血組織的生存具有重要研究意義。核因子相關(guān)因子-2(Nrf2)是機(jī)體抗氧化反應(yīng)的重要因子,其激活后可以誘導(dǎo)下游多種抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用�；A(chǔ)研究表明,缺血缺氧組織中存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),這是促使移植細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死的最重要因素。而Nrf2是否涉及移植細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境的生存調(diào)節(jié)及其具體機(jī)制尚不清楚。缺氧預(yù)處理可以增強(qiáng)多種細(xì)胞移植治療的療效和功能,Nrf2是否涉及這一過程以及機(jī)制如何,亦不清楚。因此,本研究擬應(yīng)用密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法獲得骨髓源EPCs,運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)使該EPCs過表達(dá)Nrf2或降低Nrf2表達(dá),再給予不同缺氧條件下預(yù)處理,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察不同缺氧條件下EPCs的生物學(xué)特性改變、血管生成能力及其與Nrf2的關(guān)系,探討分析Nrf2對(duì)缺氧預(yù)處理后EPCs的細(xì)胞生存、在血管生成中的作用的影響及其機(jī)制。研究方法1.內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)及其生物學(xué)特性通過密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法從大鼠骨髓獲得骨髓源EPCs,通過培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)吞試驗(yàn)和流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)記三個(gè)方法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為epcs。2.nrf2在缺氧預(yù)處理的epcs中的表達(dá)及促血管生成作用與機(jī)制研究將epcs分為四組:1)對(duì)照組;2)epcs-nrf2-sirna組;3)epcs-con-sirna組;4)epcs-nrf2組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?給予相應(yīng)缺氧預(yù)處理,并進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):1)應(yīng)用熒光探針dcfh-da試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ros水平;2)采用annexinv/pi雙染色后行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平;3)應(yīng)用mtt法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;4)應(yīng)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;5)應(yīng)用elisa法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中hif-1α和vegf水平,評(píng)價(jià)細(xì)胞旁分泌功能;6)應(yīng)用激光共聚焦檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)的nrf2核轉(zhuǎn)位情況;7)應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量rt-pcr和westernblot檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)的信號(hào)通路激活情況以及nrf2與其下游靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)情況。3.nrf2在epcs血管生成中的作用及機(jī)制體外實(shí)驗(yàn):應(yīng)用tubeformation試驗(yàn)觀察缺氧誘導(dǎo)的上述四組細(xì)胞血管生成能力;體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立心肌梗死大鼠模型,并根據(jù)移植細(xì)胞不同,即epcs、epcs-nrf2-sirna、epcs-con-sirna和epcs-nrf2,相應(yīng)分為四組:1)對(duì)照組;2)epcs-nrf2-sirna組;3)epcs-con-sirna組;4)epcs-nrf2組。細(xì)胞移植采用心肌梗死交界區(qū)直接注射細(xì)胞方法。應(yīng)用免疫熒光染色觀察不同移植細(xì)胞組28d時(shí)細(xì)胞存活和局部細(xì)胞凋亡情況;應(yīng)用cd31免疫組化染色觀察局部血管生成情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1)密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法可以獲得較大數(shù)量和高純度的epcs。2)應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)吞試驗(yàn)和流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)記cd34、cd133、kdr和cd31,證明培養(yǎng)細(xì)胞為目的細(xì)胞epcs。3)缺氧誘導(dǎo)epcs產(chǎn)生ros,并激活nrf2核內(nèi)轉(zhuǎn)位。4)sirna干擾nrf2后加重缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并抑制細(xì)胞增殖能力,并降低細(xì)胞遷移能力;而高表達(dá)nrf2抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力,但對(duì)細(xì)胞增殖能力無影響,這些結(jié)果表明,nrf2有利于維持缺氧微環(huán)境中的細(xì)胞生存。同時(shí),nrf2正性調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的epcs旁分泌功能。5)缺氧通過激活細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)途徑而促進(jìn)Nrf2表達(dá)增加,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞中HO-1和NQO1 m RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。6)缺氧誘導(dǎo)EPCs形成膠管樣結(jié)構(gòu);siRNA干擾Nrf2顯著降低缺氧誘導(dǎo)的EPCs膠管形成能力;在心肌梗死大鼠模型中,si RNA干擾Nrf2顯著減少移植EPCs的生存,伴隨著心肌梗死交界區(qū)毛細(xì)血管數(shù)目減少;過表達(dá)Nrf2則顯著促進(jìn)移植EPCs的生存,增加心肌梗死交界區(qū)毛細(xì)血管毛細(xì)血管數(shù)目。研究結(jié)論1)密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法可以獲得較大數(shù)量和高純度的EPCs;細(xì)胞內(nèi)吞試驗(yàn)和細(xì)胞表面抗原標(biāo)記CD34、CD133、KDR和CD31鑒定證實(shí)為EPCs。2)siRNA干擾Nrf2后加重缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并抑制細(xì)胞增殖能力,降低細(xì)胞遷移能力;而高表達(dá)Nrf2抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力,但對(duì)細(xì)胞增殖能力無影響,這些結(jié)果表明,Nrf2有利于維持缺氧微環(huán)境中的細(xì)胞生存。同時(shí),Nrf2正性調(diào)節(jié)缺氧預(yù)處理的EPCs的旁分泌功能。3)膠管形成試驗(yàn)和動(dòng)物在體心肌梗死模型實(shí)驗(yàn)顯示,Nrf2參與缺氧誘導(dǎo)的血管生成作用。這個(gè)可能是EPCs-Nrf2較EPCs移植治療具有更好改善心功能的原因。4)缺氧誘導(dǎo)EPCs產(chǎn)生ROS,并激活Nrf2核內(nèi)轉(zhuǎn)位。5)缺氧通過激活細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)途徑而誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)增加,而Nrf2激活并轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)HO-1和NQO1 m RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：核因子相關(guān)因子-2(Nrf2) 內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs) 血管生成 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-17
• 第二章 內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)及其生物學(xué)特性17-30
• 2.1 材料與方法17-22
• 2.2 結(jié)果22-24
• 2.3 討論24-29
• 2.4 小結(jié)29-30
• 第三章 Nrf2在缺氧預(yù)處理的EPCs中的表達(dá)及促血管生成作用和機(jī)制30-61
• 3.1 材料與方法30-37
• 3.2 結(jié)果37-54
• 3.3 討論54-60
• 3.4 小結(jié)60-61
• 第四章 Nrf2在EPCs血管生成中的作用及機(jī)制61-73
• 4.1 材料與方法61-64
• 4.2 結(jié)果64-70
• 4.3 討論70-72
• 4.4 小結(jié)72-73
• 全文結(jié)論73-74
• 本研究的創(chuàng)新之處74-75
• 參考文獻(xiàn)75-88
• 文獻(xiàn)綜述一Nrf2與內(nèi)皮功能和心血管保護(hù)88-102
• 參考文獻(xiàn)95-102
• 文獻(xiàn)綜述二micro RNAs與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病研究進(jìn)展102-138
• 參考文獻(xiàn)122-138
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的文章138-139
• 致謝139

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 何小解;許自川;鄭洪;黨西強(qiáng);易著文;曾雪琪;;大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分離與體外培養(yǎng)條件研究[J];世界科技研究與發(fā)展;2008年02期

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本文編號(hào)：1053566