本文關(guān)鍵詞：重組慢病毒介導(dǎo)的LXRα-RNAi與rHuEPo聯(lián)合運(yùn)用改善大鼠脂肪肝供肝肝移植術(shù)后移植肝功能的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：第—部分脂肪肝供體大鼠模型的建立目的：建立穩(wěn)定的大鼠中重度脂肪變性的肝臟供體模型,為進(jìn)一步研究改善中重度脂肪肝供肝術(shù)后移植物功能及延長(zhǎng)生存期的問題提供前提條件。方法：將體重60～90g SD大鼠310只隨機(jī)分成對(duì)照組和模型組各155只,對(duì)照組喂飼基礎(chǔ)飼料,模型組喂飼富含飽和脂肪酸的高脂飼料同時(shí)以56% 酒精隔天灌胃,實(shí)驗(yàn)期間每天觀察大鼠一般情況,每周定期稱量各組大鼠體重,第2、4、8周末檢測(cè)大鼠肝臟指數(shù)、外周血血脂、肝功能,并評(píng)估肝組織病理學(xué)改變,按照脂肪肝組織學(xué)診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠脂肪肝模型進(jìn)行鑒定。結(jié)果：模型組大鼠在8周末時(shí)形成脂肪浸潤(rùn)程度≥50%的脂肪肝,大鼠體重、肝濕重、肝臟指數(shù)、肝酶學(xué)和外周血血脂檢測(cè)結(jié)果明顯高于對(duì)照組(P0.05),脂肪肝發(fā)生率100%。結(jié)論：富含飽和脂肪酸的高脂飲食及酒精持續(xù)喂養(yǎng)SD大鼠8周成功構(gòu)建了脂肪肝供體大鼠模型,成功率100%。該模型的特點(diǎn)為肝組織脂肪變性程度：F3-4級(jí)；以大泡性脂肪變性為主；伴隨高脂血癥及血清轉(zhuǎn)氨酶輕度升高。第二部分?jǐn)y帶LXRa/GV115-RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及體外對(duì)大鼠肝細(xì)胞基因表達(dá)的影響目的：運(yùn)用RNA干擾技術(shù),對(duì)大鼠LXRα基因進(jìn)行基因修飾后,構(gòu)建LXPα基因干擾的慢病毒載體并進(jìn)行鑒定,同時(shí)對(duì)大鼠肝細(xì)胞系BRL進(jìn)行轉(zhuǎn)染,觀察基因干擾效率。方法：第一步,首先構(gòu)建成功的目的基因RNA干擾的慢病毒載體,然后設(shè)計(jì)多個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列,選擇最佳的動(dòng)力學(xué)參數(shù)靶點(diǎn),制備雙鏈DNA Oligo,制備并鑒定克隆；第二步,進(jìn)行RNA干擾慢病毒的包裝與滴度檢測(cè),首先制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒,三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提,后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增,得到慢病毒濃縮液后在293T細(xì)胞中測(cè)定并標(biāo)定病毒滴度；第三步,使用慢病毒感染目的肝細(xì)胞系BRL,根據(jù)細(xì)胞MOI值,調(diào)整病毒量,感染3天后觀察慢病毒上報(bào)告基因GFP表達(dá)情況,熒光率大于80%者,并提取RNA,使用RT-PCR法測(cè)定滴度及內(nèi)源性驗(yàn)證基因敲減效率。結(jié)果：經(jīng)查詢,目的基因?yàn)镹r1h3 (LXRa),基因序列號(hào)為NM_031627,合成針對(duì)靶基因的四個(gè)攜帶干擾基因的慢病毒載體：Nrlh3/GV115-RNAi-LV#1,Nr1h3/GV115-RNAi-LV#2,Nr1h3/GV115-RNAi-LV#3及Nr1h3/GV115-RNAi-LV#4,目的細(xì)胞感染效率達(dá)到了80%以上,經(jīng)RT-PCR測(cè)定,Nr1h3/GV115-RNAi-LV#4作為目標(biāo)靶點(diǎn)序列的慢病毒載體敲減效率最高。經(jīng)過慢病毒載體包裝,最終鑒定KD4組對(duì)大鼠肝細(xì)胞系BRL的LXRα基因的干擾效率是大于80%,達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。結(jié)論：1、成功構(gòu)建、合成、篩選出了LXRα-RNAi-LV,干擾效率達(dá)80%以上。2、LXRα-RNAi-LV能在體外有效轉(zhuǎn)染大鼠BRL系列肝細(xì)胞并抑制LXRα基因的表達(dá)。第三部分大鼠原位脂肪肝供肝減體積肝移植模型的建立目的：建立適合脂肪肝供肝的穩(wěn)定的大鼠減體積肝移植模型,解決供肝體積明顯大于受體原肝體積,遮擋手術(shù)視野增加手術(shù)難度及大體積供肝血液灌注增加致受體復(fù)流后血容量不足的問題,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供成功的動(dòng)物模型保障。方法：隨機(jī)各選取20對(duì)SD-SD脂肪肝供肝肝移植大鼠,對(duì)照組進(jìn)行全體積原位肝移植術(shù),實(shí)驗(yàn)組在供肝獲取后切除肝左外側(cè)葉(約占全肝體積30%),后繼續(xù)行原位肝移植術(shù)。兩組均采用“二袖套法”。供肝恢復(fù)灌流后,觀察記錄兩組大鼠呼吸動(dòng)度、呼吸頻率、心跳及大血管充盈情況,術(shù)后觀察大鼠一般恢復(fù)情況,解剖死亡大鼠了解死因；記錄兩組手術(shù)時(shí)間并作比較；兩組大鼠術(shù)后進(jìn)行生存分析；比較兩組大鼠術(shù)后肝功能及病理組織學(xué)改變,評(píng)估兩組差異性。結(jié)果：供肝恢復(fù)灌注后,全體積肝移植組受體大鼠呼吸頻率、心率快于減體積肝移植組受體大鼠(P0.05),下腔靜脈充盈情況原體積肝移植組大鼠相對(duì)較差；減體積組受體大鼠術(shù)后一般情況恢復(fù)好于全體積組大鼠；手術(shù)時(shí)間,全體積組修肝時(shí)間短于減體積組,但受體手術(shù)時(shí)間明顯長(zhǎng)于減體積組(P0.05),全體積組受體大鼠術(shù)后早期死亡率明顯高于減體積組,主要死亡原因是腹腔出血、空氣栓塞和低血容量性休克,兩組受體大鼠后續(xù)存活時(shí)間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；兩組受體大鼠術(shù)后肝功能肝酶學(xué)和總膽紅素總體無差異,病理組織學(xué)表現(xiàn)相似。結(jié)論：在“二袖套法”基礎(chǔ)上建立的脂肪肝供肝大鼠減體積肝移植模型穩(wěn)定可靠,并未增加受體大鼠的死亡率及肝功能不全,解決了脂肪肝供肝全體積肝移植術(shù)中術(shù)野暴露不清、術(shù)后易致受體大鼠循環(huán)失穩(wěn)的問題,是研究脂肪肝供肝肝移植的理想動(dòng)物模型之一。第四部分重組慢病毒介導(dǎo)的LXRa-RNAi與rHuEPo聯(lián)合運(yùn)用改善大鼠脂肪肝供肝肝移植術(shù)后移植肝功能的實(shí)驗(yàn)研究目的：應(yīng)用攜帶LXRα-RNAi基因干擾的重組慢病毒載體聯(lián)合rHuEPo對(duì)中重度脂肪肝供肝肝移植大鼠進(jìn)行干預(yù),以改善受體大鼠術(shù)后移植肝功能,提高生存率,為臨床上對(duì)中重度脂肪肝供肝使用的進(jìn)一步研究打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：以第一、三部分所建成功的脂肪肝供肝大鼠減體積肝移植模型和第二部分構(gòu)建及擴(kuò)增的慢病毒載體為基礎(chǔ),實(shí)驗(yàn)分為五個(gè)組(n=20),聯(lián)合治療組：移植供受體大鼠接受LXRα-KNAi-LV和rHuEPo的聯(lián)合治療。脂肪肝供體大鼠在肝移植手術(shù)前72h接受經(jīng)盲腸靜脈至門靜脈注射LXRα-RNM-LV病毒載體液1ml(為病毒液溶于ENI.S.稀釋成濃度7×107 TU/ml并和感染增效劑Polybrene混合組成),脂肪肝供體大鼠在供肝切取前30min接受經(jīng)門靜脈注射rHuEPo稀釋液lml(生理鹽水溶解),用量為4000IU/kg,受體在移植肝開放復(fù)流后經(jīng)尾靜脈快速加壓注射同等劑量rHuEPo稀釋液；基因治療組：移植供體大鼠接受jLXR∝-RNAi-LV單獨(dú)治療；rHuEPo治療組：移植供受體大鼠接受rHuEPo單獨(dú)治療；空白病毒組：移植供受體接受空白病毒NC-LV轉(zhuǎn)染和生理鹽水注射；空白對(duì)照組：移植供受體僅接受生理鹽水注射。肝移植術(shù)后在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)4h、24h、72h處死大鼠,獲取肝臟標(biāo)本及血清進(jìn)行相關(guān)檢測(cè),包括：冰凍切片的熒光檢測(cè),肝功能及外周血脂、肝組織內(nèi)TG測(cè)定,ELISA法測(cè)定血清IL1-β和TNF-a,病理組織學(xué)變化的評(píng)估,TUNEL法檢測(cè)肝組織細(xì)胞凋亡情況,免疫組化法檢測(cè)NF-κBp65在肝組織中的表達(dá)情況,LXRa的RT-PCR檢測(cè)和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)LXRα、 SREBP-1c及CD36表達(dá)的檢測(cè)以及對(duì)各組大鼠的生存評(píng)估。結(jié)果：(1)供體大鼠肝臟經(jīng)門靜脈轉(zhuǎn)染攜帶GFP綠色熒光蛋白的慢病毒載體72h后,可見肝組織有普遍強(qiáng)綠色熒光表達(dá),主要集中在肝小葉匯管區(qū)及中央靜脈周圍的肝細(xì)胞,表明慢病毒載體攜帶的干擾基因已高效地轉(zhuǎn)染入供肝細(xì)胞。(2)生化指標(biāo)檢測(cè)情況：聯(lián)合治療組大鼠術(shù)后肝功能ALT和TBIL前24h升高幅度明顯低于其他組(P0.05),72h時(shí)逐漸下降；而兩空白組ALT前24h明顯升高,72h時(shí)大幅下降,TBIL則持續(xù)升高；基因治療組和rHuEPo治療組數(shù)值居中,但基因治療組升高幅度低于rHuEPo治療組。各組外周血血脂數(shù)值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肝組織內(nèi)TG含量,聯(lián)合治療組和基因治療組明顯低于其他三組(P0.05),并呈持續(xù)下降趨勢(shì)。(3)細(xì)胞因子檢測(cè)情況：聯(lián)合治療組兩細(xì)胞因子濃度升高幅度在各時(shí)間點(diǎn)明顯低于其他各組(P0.05)：基因治療組兩細(xì)胞因子濃度升高幅度低于rHuEPo治療組；空白病毒組和空白對(duì)照組血清兩細(xì)胞因子濃度在各時(shí)間點(diǎn)始終高于其他組(P0.05),兩組間濃度值無差異。(4)病理組織學(xué)檢查：聯(lián)合治療組和基因治療組切片顯示肝小葉中央靜脈周圍肝組織內(nèi)脂肪蓄積減少,脂滴對(duì)肝小葉匯管區(qū)、中央靜脈擠壓明顯減輕。經(jīng)過Suzuki評(píng)分,聯(lián)合治療組肝組織病理?yè)p傷在各組中最輕(P0.05),空白病毒組和空白對(duì)照組大鼠肝組織損傷嚴(yán)重,72h時(shí)肝組織呈大片狀壞死。(5) TUNEL染色結(jié)果：在4h時(shí)間點(diǎn),聯(lián)合治療組和基因治療組間肝細(xì)胞凋亡率無差別,但明顯低于其他三組(P0.05)；24h時(shí),聯(lián)合治療組肝細(xì)胞凋亡率明顯低于其他各組(P0.05)；72h時(shí),聯(lián)合治療組肝細(xì)胞凋亡率仍持續(xù)最低(P0.05),并較24h時(shí)有所下降,基因治療組則排在其次,另三組相對(duì)較高。(6) NF-κBp65的表達(dá)：聯(lián)合治療組大鼠肝組織在4h平均積分吸光度值最低,24h時(shí)數(shù)值升高超過基因治療組,72h時(shí)下降與基因治療組無差異；rHuEPo治療組4h時(shí)數(shù)值高于前兩組但低于兩空白組,24h時(shí)數(shù)值升高達(dá)高峰并明顯高于其他組,72h時(shí)下降；空白病毒組和空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)平均積分吸光度值高于聯(lián)合治療組和基因治療組。(7) Western blot測(cè)定LXRα、SREBP-1c及CD36的表達(dá)：聯(lián)合治療組和基因治療組肝組織內(nèi)LXRα、SREBP-1c及CD36三種蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯低于另三組(P0.05)。(8) LXRα RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：聯(lián)合治療組和基因治療組肝組織內(nèi)LXRα mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于另三組(P0.05)。(9)聯(lián)合治療組術(shù)后7天生存率為80%,明顯高于其他任何一組大鼠(P0.05),聯(lián)合治療組大鼠術(shù)后長(zhǎng)時(shí)間生存率有明顯提高。結(jié)論：1、經(jīng)盲腸靜脈屬支穿刺置管門靜脈灌注是慢病毒攜帶基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染安全有效的途徑,可保證大鼠存活及較高的基因轉(zhuǎn)染效率,是大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的一種值得推廣的方法。但慢病毒的無靶向性及仍然存在的潛在生物學(xué)危險(xiǎn)是其局限性。2、 未經(jīng)治療≥50% 脂肪浸潤(rùn)的大鼠供肝,其大鼠肝移植受體術(shù)后短時(shí)間(4h)即可發(fā)生肝組織壞死,術(shù)后三天肝組織大片壞死,生存率低,原因可能是肝臟嚴(yán)重缺血再灌注損傷引發(fā)PNF導(dǎo)致。3、運(yùn)用慢病毒攜帶LXRα-RNAi-LV的載體液經(jīng)門靜脈轉(zhuǎn)染供肝并聯(lián)合rHuEPo治療,有效減輕了脂肪肝供肝大鼠肝移植術(shù)后移植肝的缺血再灌注損傷,提高了受體大鼠術(shù)后的存活率,延長(zhǎng)了存活時(shí)間,其治療效果優(yōu)于單獨(dú)運(yùn)用LXRα基因干擾治療或rHuEPo治療,是一種有效改善脂肪肝移植物術(shù)后肝功能的方法,為進(jìn)一步研究應(yīng)用中重度脂肪肝作為供肝的課題打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：中重度脂肪肝 高脂飲食 酒精 大鼠模型 LXRα RNA干擾 慢病毒載體 BRL大鼠肝細(xì)胞系 轉(zhuǎn)染 脂肪肝供肝 全體積肝移植 減體積肝移植 大鼠 LXRα RNA干擾 慢病毒載體 rHuEPo 脂肪肝供肝 肝移植 缺血再灌注損傷
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R657.3
【目錄】：

• 中英文縮寫對(duì)照表6-7
• 前言7-9
• 中文摘要9-15
• 英文摘要15-20
• 第一部分 脂肪肝供體大鼠模型的建立20-31
• 引言20
• 實(shí)驗(yàn)材料及方法20-25
• 結(jié)果25-28
• 討論28-30
• 結(jié)論30-31
• 第二部分 攜帶LXRα/GV115-RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及體外對(duì)大鼠肝胞基因表達(dá)的影響31-68
• 引言31-32
• 實(shí)驗(yàn)材料及方法32-48
• 結(jié)果48-65
• 討論65-67
• 結(jié)論67-68
• 第三部分 大鼠原位脂肪肝供肝減體積肝移植模型的建立68-93
• 引言68
• 實(shí)驗(yàn)材料及方法68-81
• 結(jié)果81-85
• 討論85-92
• 結(jié)論92-93
• 第四部分 重組慢病毒介導(dǎo)的LXRα-RNAi與rHuEPo聯(lián)合運(yùn)用改善大鼠脂肪肝供肝肝移植術(shù)后移植肝功能的實(shí)驗(yàn)研究93-139
• 引言93-94
• 實(shí)驗(yàn)材料及方法94-112
• 結(jié)果112-129
• 討論129-138
• 結(jié)論138-139
• 參考文獻(xiàn)139-151
• 綜述151-164
• 參考文獻(xiàn)158-164
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況164-165
• 致謝165

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉憲華,張玲;PPARγ及其配體在腎臟組織中生物學(xué)作用的研究進(jìn)展[J];重慶醫(yī)學(xué);2005年08期

2 江恒;陳克力;何建明;陳文生;梁后杰;;代謝性核受體在結(jié)腸癌中的表達(dá)及意義[J];重慶醫(yī)學(xué);2009年12期

3 趙英鵬;李立;馬菁番;白建華;劉其雨;;不同轉(zhuǎn)染途徑對(duì)慢病毒載體基因在大鼠肝臟中表達(dá)的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年01期

4 胡建平,陸森,錢建民,孫倍成,王學(xué)浩;兩袖套法減體積大鼠肝移植手術(shù)技巧[J];河北醫(yī)學(xué);2003年01期

5 陶詩(shī)奇;崔翔;郭文瓊;徐海偉;范曉棠;;肝X受體與神經(jīng)免疫研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2011年04期

6 馮志強(qiáng);沈志祥;譚詩(shī)云;羅和生;漆楚波;郭潔;李海霞;;大鼠急性酒精性脂肪肝造模方法的改進(jìn)[J];世界華人消化雜志;2003年08期

7 史冀華;朱盛興;張水軍;;大鼠肝部分切除術(shù)的應(yīng)用解剖及實(shí)施[J];世界華人消化雜志;2008年22期

8 羅煥敏,鄧惠,黃豐;RNA干擾對(duì)老年性癡呆癥的治療機(jī)制研究[J];中國(guó)病理生理雜志;2005年02期

9 程少冰;楊欽河;張玉佩;楊環(huán)文;謝芳;薛川松;歐健;;三七總皂甙對(duì)脂肪變性L02肝細(xì)胞TG含量及LXRα mRNA表達(dá)的影響[J];中國(guó)病理生理雜志;2010年06期

10 ;非酒精性脂肪性肝病診療指南[J];中華肝臟病雜志;2006年03期

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本文編號(hào)：1053401