本文關(guān)鍵詞：磷酸鈣與聚甲基丙烯酸甲酯制備復(fù)合型骨水泥的生物學(xué)研究

  更多相關(guān)文章： 磷酸鈣 聚甲基丙烯酸甲酯 骨水泥 生物學(xué)

【摘要】：研究背景21世紀進行組織修復(fù)的最佳方式是利用組織工程學(xué)材料短期內(nèi)替代自身受損或缺損的組織,待機體自身組織細胞增殖或再生后重新獲得修復(fù)。臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)：創(chuàng)傷骨折、骨組織感染壞死、骨腫瘤、骨質(zhì)疏松、椎體壓縮性骨折等疾病術(shù)前或術(shù)后常常合并骨缺損,而臨床的最終治療目的是盡可能的恢復(fù)骨組織的結(jié)構(gòu)、填補骨缺損從而保證機體的運動功能。以往的臨床治療經(jīng)驗表明：自體骨移植是治療骨缺損的金標準,因為自體骨不僅具有骨傳導(dǎo)性、還具有骨誘導(dǎo)性和成骨活性,但是對于長段骨缺損的患者來說,單純依靠自身骨組織再生來獲得長段骨缺損的修復(fù)是十分困難的,因為來源有限,即便是采取自體骨移植,也存在“拆東墻、補西墻”的問題,也容易造成患者機體的二次損傷和再發(fā)感染、血腫、神經(jīng)損傷等并發(fā)癥,給患者帶來巨大的軀體和精神上的痛苦。當(dāng)然,還有同種異體骨移植法,雖然異體骨來源較為廣泛,但免疫原性和致病性等問題一直是醫(yī)療界公認的難題,故同種異體骨也不是骨組織缺損最理想的修復(fù)材料。近年來,生物醫(yī)學(xué)工程所提出的骨生物材料得到飛快發(fā)展,其理念為：1.生物安全性良好,對人體無害無毒或低毒無損害；2.抗壓強度較高,可起到一定的支撐作用；3.具有一定的微孔結(jié)構(gòu),有利于骨細胞的長入；4.具有可降解性,隨著機體骨髓腔結(jié)構(gòu)變化逐步降解被周圍骨質(zhì)所替代；5.具有一定的引導(dǎo)或誘導(dǎo)成骨活性,更利于骨缺損區(qū)域發(fā)揮促成骨作用,彌補骨質(zhì)不良的缺陷；6.材料具有可塑性,可以根據(jù)自身需要滿足不同的移植部位。隨著近幾年學(xué)者們對人工合成骨材料的廣泛、深入的研究,金屬、生物陶瓷、高分子聚合物、骨水泥等得到臨床較為廣泛的應(yīng)用、效果頗為顯著。為獲得多種材料取長補短的最佳優(yōu)勢組合,以達到完美模擬自體骨在體內(nèi)促進成骨的目的,許多學(xué)者將無機材料與有機材料進行結(jié)合,制造出各種復(fù)合型骨組織替代材料,最大程度的滿足了機體骨骼修復(fù)的需求,當(dāng)然這些復(fù)合型骨組織替代材料同樣具備如下條件：1.生物安全性良好；2.材料本身具有一定的微孔結(jié)構(gòu)或材料的顆粒之間具有一定的孔徑距離,有利于骨細胞的長入；3.具有可降解性；4.具有一定的引導(dǎo)或誘導(dǎo)成骨活性；5.材料具有一定的可塑性,可以根據(jù)骨缺損部位的空間需要滿足不同的移植需求；6.最大程度的滿足骨材料移植部位的生物力學(xué)強度。因此,本課題研究是尋找一種適合于機體負重區(qū)域的骨材料移植,既具有即刻穩(wěn)定性、又具有中長期穩(wěn)定性,同時兼?zhèn)洌嚎箟耗芰姴⒕哂幸欢ǹ伤苄�、具有骨引�?dǎo)活性或骨誘導(dǎo)活性、生物相容性好的多重功能的骨組織生物材料,結(jié)合本課題選擇的骨水泥材料磷酸鈣(CPC)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA),我們非常希望看到的是CPC和PMMA它們各自的優(yōu)點得到重新組合,獲得新的復(fù)合型骨組織生物材料,復(fù)合后的新型生物材料仍然能夠保持著自身的優(yōu)勢,即CPC：降解速度中等(一般為3-6個月)、降解產(chǎn)物與骨骼成份相似、與骨骼結(jié)合牢固、具有骨引導(dǎo)活性、可載入抗生素藥物和相關(guān)活性因子成份或活性抑制因子成份。當(dāng)然,目前臨床上對硫酸鈣(CaS)的應(yīng)用也非常廣泛,本課題之所以不選取CaS作為復(fù)合型骨水泥的復(fù)合成份之一,是因為與CPC相比,CaS骨水泥降解過快(一般為1-3個月)、機械抗壓強度較弱(臨床上多將CaS應(yīng)用于肢體非負重區(qū)域的骨缺損移植),因此本組實驗設(shè)計之初就選擇了CPC作為該實驗的復(fù)合成份,而PMMA在抗壓強度、抗拉伸強度及抗折強度等生物力學(xué)方面卻具有CPC和CaS都不具備的強大優(yōu)勢,但PMMA終生無法降解、不利于成骨或新生骨長入是其缺陷所在。不難看出,CPC、CaS和PMMA作為骨組織植入材料的獨立個體,都與達到最理想狀態(tài)的骨組織生物材料的標準具有一定的差距。我們設(shè)想：如果能夠?qū)PC和PMMA復(fù)合成功,使復(fù)合型骨水泥(CPC/PMMA)兼顧CPC和PMMA的獨立優(yōu)勢,甚至達到1+12的效果：中等速度降解,與原骨骼結(jié)合牢固、具有骨引導(dǎo)活性并允許新生骨組織的長入、可載入抗生素和相關(guān)活性因子或活性抑制因子成份進入骨缺損區(qū)域或骨組織壞死區(qū)域發(fā)揮作用,且隨著CPC的緩慢降解同時獲得PMMA強大抗壓、抗拉伸及抗折的力學(xué)性能,滿足機體負重區(qū)域或非負重區(qū)域均可植入該復(fù)合型骨水泥材料以達到最佳治療模式的需求。目的1.探討磷酸鈣(CPC)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)按不同比例混合而制備新型復(fù)合型骨水泥(CPC/PMMA)的方法及生物力學(xué)性能。2.探討復(fù)合型骨水泥材料CPC/PMMA生物安全性、組織相容性。3.探索復(fù)合型骨水泥材料CPC/PMMA移植入SD大鼠脛骨臨界性骨缺損處,觀察測量其降解及骨缺損修復(fù)情況。4.篩選出CPC/PMMA最佳配比濃度,滿足機體負重區(qū)域或非負重區(qū)域均可植入該復(fù)合型骨水泥材料以達到最佳治療模式的需要。方法1.復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA的制備與分組制備CPC(100%)組、PMMA (100%)組、CPC/PMMA (3/1,75%)組、CPC/PMMA (2/1,67%)組、CPC/PMMA (1/1,50%)組、CPC/PMMA (1/2,33%)組、CPC/PMMA (1/5,16.7%)組、CPC/PMMA (1/10,9.1%)組、CPC/PMMA (1/15,6.25%)組、CPC/PMMA (1/20,4.8%)組骨水泥試件。2.復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA生物安全性檢測2.1細胞毒性實驗2.1.1各組骨水泥浸提液的制備將無菌條件下制成的CPC、PMMA、CPC+PMMA復(fù)合骨水泥各組：CPC/PMMA (75%)組、CPC/PMMA (67%)組、CPC/PMMA (50%)組、CPC/PMMA(33%)組、CPC/PMMA (16.7%)組、CPC/PMMA (9.1%)組、CPC/PMMA(6.25%)組、CPC/PMMA (4.8%)組材料試件分別置于培養(yǎng)基中,3 cm2/ml培養(yǎng)基37℃中120 h,制備CPC、PMMA、復(fù)合骨水泥(CPC+PMMA)各組浸提液。2.1.2成骨前體細胞(MC3T3-E1,小鼠來源)的體外培養(yǎng)遵照細胞體外培養(yǎng)技術(shù)與原則。2.2全身亞急性毒性實驗本課題相關(guān)實驗動物,我們都遵循實驗動物保護原則。將雌雄各半的昆明小鼠隨機分組,體重25g-30g、5只/組,并進行標記,利用電子天平測量各組小鼠的體重。各組小鼠按50ml/kg注射骨水泥浸提液(腹腔注射),Control組注射生理鹽水。注射后24h、7d、14d觀察各組小鼠的一般狀態(tài)(皮膚、被毛、眼、粘膜變化)、存活情況(呼吸、循環(huán)、行為等),并測量體重及組織臟器變化情況。2.3熱源實驗無菌條件下制備CPC(100%)組、CPC/PMMA (75%)組、CPC/PMMA (67%)組、CPC/PMMA (50%)組、CPC/PMMA (33%)組、CPC/PMMA (16.7%)組、CPC/PMMA (9.1%)組、CPC/PMMA (6.25%)組、CPC/PMMA (4.8%)組、PMMA (100%)組浸提液。鼠尾靜脈注射骨水泥浸提液、3m1浸提液/只(對照組注射生理鹽水)。分別注射后1h、2h、3h、24h測定SD大鼠的肛溫變化值。每只SD大鼠測3次取平均值。2.4致敏實驗：于SD大鼠小腿內(nèi)側(cè)注入骨水泥浸提液、0.1ml/點(對照組注射生理鹽水)。分別注射后15min、30min、1h、24h觀察SD大鼠注射點的紅斑、水腫、硬結(jié)及焦痂等形成情況。3.復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA理化性能的檢測3.1初級性能檢測：3.1.1抗壓強度、拉伸強度及三點彎實驗：將CPC(100%)組、CPC/PMMA(75%)組、CPC/PMMA(67%)組、CPC/PMMA(50%)組、CPC/PMMA (33%)組、CPC/PMMA (16.7%)組、CPC/PMMA(9.1%)組、CPC/PMMA (6.25%)組、CPC/PMMA (4.8%)組、PMMA(100%)組骨水泥在常溫下調(diào)和均勻后注入不銹鋼模具中塑形,制成圓柱體(直徑5mm,高度10mm-50mm不等),我們稱之為“骨水泥試件”。將骨水泥試件分別放置于ELF3510-AT萬能材料實驗機(BOSES公司,美國)上,預(yù)先制作的夾具以精確測定加載的力學(xué)參數(shù),進行三點彎實驗；于Instron(英斯特朗)萬能材料實驗機(美國)上,進行抗壓強度、拉伸強度的測試。3.1.2凝固溫度檢測3.2高級性能檢測3.2.1固化時間檢測3.2.2電鏡掃描形態(tài)學(xué)觀察3.2.3物相組成份析檢測4.復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA的組織相容性實驗4.1細胞粘附實驗：顯微鏡下觀察12孔板中骨水泥試件周圍的細胞生長形態(tài)與狀態(tài)。4.2骨水泥試件植入臨界性骨缺損、肌袋組織中的動物模型建立。4.3骨水泥試件植入術(shù)后動物模型的X線檢查(術(shù)后4周、12周、15周)。4.4骨水泥試件失重率的測試。4.5 SD大鼠脛骨臨界性骨缺損骨材料移植模型術(shù)后的組織形態(tài)學(xué)觀察及新生骨測量。結(jié)果1.復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA的制備將CPC和PMMA骨水泥的同相粉末按質(zhì)量比3：1,2：1,1：1,1：2,1：5,1：10,1：15,1：20均勻混合得到不同比例的混合骨水泥固相系列：CPC/PMMA(75%)組、CPC/PMMA (67%)組、CPC/PMMA(50%)組、CPC/PMMA (33%)組、CPC/PMMA (16.7%)組、CPC/PMMA (9.1%)組、CPC/PMMA (6.25%)組、CPC/PMMA (4.8%)組,根據(jù)本課題實驗的需要,分別制備出與檢測要求相符合的骨水泥試件。2.1細胞毒性分級標準分為6個級別：0級為≥100%,1級為75%-99%,2級為50%-74%,3級為26%-49%,4級為1%-25%,5級為0。無毒性即為0級,高毒性為5級。與空白對照組比較,骨水泥浸提液CPC/PMMA (16.7%)組,CPC/PMMA (9.10%)組,CPC/PMMA (6.25%)組,CPC/PMMA (4.80%)組和PMMA組有細胞毒性。2.2全身亞急性毒性實驗各組SD大鼠機體狀態(tài)指標變化無顯著性差異。2.3熱源實驗實驗各組SD大鼠體溫變化無顯著性差異。2.4致敏實驗結(jié)果顯示：PMMA單體組的SD大鼠皮膚注射區(qū)域出現(xiàn)明顯的點狀紅斑和水腫,而在其他各組沒有此種現(xiàn)象出現(xiàn)。2.5溶血實驗溶血率(%)=(實驗組吸光度-陰性對照組吸光度)/(陽性對照組吸光度-陰性對照組吸光度)×100%。結(jié)果評價：如果溶血率小于5%,可判定合格,即所檢測的材料不會引起溶血反應(yīng)。2.6病理學(xué)檢測血液常規(guī)檢包括測定：紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)、血小板數(shù)、血紅蛋白、紅細胞壓積和平均紅細胞體積。血液生化檢測包括測定：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、尿素氮、總蛋白、血糖、總膽固醇、肌酐、甘油三酯等指標。2.7病理組織學(xué)檢測：進行小鼠尸檢,檢測肌袋、肝、脾、腎臟器的濕重,再進行甲醛固定后石蠟切片、HE染色鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)。3.1抗壓強度、抗拉伸強度及三點彎實驗的抗折強度結(jié)果顯示：CPC(100%)組,CPC/PMMA (75%)組、CPC/PMMA (67%)組、CPC/PMMA (50%)組、CPC/PMMA (33%)組、CPC/PMMA (16.7%)組、CPC/PMMA (9.1%)組、CPC/PMMA (6.25%)組、CPC/PMMA (4.8%)組和PMMA (100%)組的抗壓強度、抗拉伸強度及抗折強度均有顯著性差異(P0.05)。3.2凝固溫度CPC(100%)組為對照組,其凝固溫度與室溫接近約為27℃,CPC/PMMA(75%)組、CPC/PMMA (67%)組、CPC/PMMA (50%)組、CPC/PMMA (33%)組、CPC/PMMA (16.7%)組、CPC/PMMA (9.1%)組、CPC/PMMA (6.25%)組、CPC/PMMA(4.8%)組、PMMA (100%)組的凝固溫度有顯著性差異(P0.05),各組復(fù)合型骨水泥凝固溫度介于40℃-80℃之間,而PMMA組凝固溫度最高達78℃左右。3.3固化時間CPC(100%)組固化時間較長、約11min, PMMA (100%)組固化時間較短、約2min,復(fù)合型骨水泥組的固化時間介于2min-6min之間,以PMMA (100%)組為對照組,CPC/PMMA (75%)組、CPC/PMMA (67%)組、CPC/PMMA (50%)組、CPC/PMMA (33%)組、CPC/PMMA (16.7%)組、CPC/PMMA (9.1%)組、CPC/PMMA (6.25%)組、CPC/PMMA (4.8%)組和CPC(100%)組為試驗組,各試驗組的固化時間均有顯著性差異(P0.05)。3.4電鏡掃描形態(tài)學(xué)觀察(×500倍)：各組骨水泥經(jīng)過PMMA單體液調(diào)和后顆粒呈球狀、部分參雜晶體顆粒,CPC(100%)組顆粒間的孔徑分布松散、孔徑距離在100μm-400μm之間,PMMA(100%)組和復(fù)合骨水泥CPC/PMMA (4.8%)組的球狀顆粒排布緊密、顆粒間孔徑距離在50 μm-100μm之間,CPC/PMMA (75%)組,CPC/PMMA (67%)組和CPC/PMMA (50%)組的孔徑介于CPC(100%)組和PMMA (100%)組之間、約100 μm-200μm。3.5物相組成份析測試通過與國際衍射數(shù)據(jù)中心的粉末衍射標準卡對照顯示,PMMA骨水泥為無結(jié)晶衍射峰出現(xiàn)的非晶態(tài)物質(zhì),僅有硫酸鋇的結(jié)晶衍射峰呈現(xiàn)；而CPC則正常顯示出以羥基磷灰石為主的結(jié)晶衍射峰,混合后的復(fù)合型骨水泥隨著PMMA的不斷增加,原來低結(jié)晶度的CPC的結(jié)晶性能略有降低,但CPC與PMMA的混合并未明顯影響終產(chǎn)物羥基磷灰石的衍射峰,提示：無新的結(jié)晶相出現(xiàn)在反應(yīng)物中,即PMMA并不參與CPC的固化反應(yīng)。4.1細胞粘附實驗顯微鏡下觀察12孔板中骨水泥試件與成骨前體細胞(MC3T3-EI)共培養(yǎng)的細胞生長情況。4.2骨水泥試件植入SD大鼠脛骨臨界性骨缺損動物模型建立。4.3.1骨水泥試件植入SD大鼠脛骨臨界性骨缺損術(shù)后4周,動物模型的X線檢查。影像學(xué)檢查結(jié)果提示：骨水泥明顯存在于各組脛骨臨界性骨缺損填充處,術(shù)后4周各組尚未見到骨水泥有顯著性降解。4.3.2骨水泥試件植入術(shù)后12周,動物模型的X線觀察CPC組骨材料降解情況較術(shù)后4周骨降解略明顯,尤其是脛骨骨缺損邊緣處的骨水泥、與周圍骨組織間出現(xiàn)模糊陰影；PMMA組術(shù)后12周依然沒有明顯降解,骨水泥邊緣整齊、周圍骨質(zhì)殘存透亮影。4.3.3骨水泥試件植入SD大鼠脛骨臨界性骨缺損術(shù)后15周X線觀察CPC組骨材料降解情況較術(shù)后12周骨降解明顯,脛骨骨缺損處的骨水泥陰影模糊增強、與周圍骨組織連接緊密；PMMA組術(shù)后15周沒有明顯降解,骨水泥邊緣整齊、周圍骨質(zhì)的透亮影消失。4.4組織形態(tài)學(xué)檢測1.空白對照組(無骨水泥填充),可見骨缺損處大量纖維結(jié)締組織結(jié)構(gòu),新骨細胞生長連接后形成的骨皮質(zhì)較薄弱、易斷裂,不易修復(fù)骨缺損。2.CPC(100%)組：CPC大部分降解,可見在其周邊大量新生骨長入并與周圍骨組織結(jié)合緊密,髓腔呈現(xiàn)再通趨勢。3. PMMA組：PMMA骨水泥無降解,可見在其周邊有少量骨長入,纖維結(jié)締組織較多,未見骨壞死等現(xiàn)象。CPC/PMMA復(fù)合骨水泥組(以75%組為代表)：復(fù)合骨水泥部分降解,可見在其周邊大量新骨形成沿復(fù)合骨水泥表面生長并與周圍骨組織連接形成“骨橋樣結(jié)構(gòu)”,形成的骨皮質(zhì)連續(xù)且與原骨骼結(jié)合牢固,髓腔也呈現(xiàn)再通趨勢。結(jié)論1.采用骨水泥CPC+PMMA為原料,物理條件下將兩者按照不同質(zhì)量比混合,以PMMA單體液調(diào)和,制備了新型復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA,制備過程簡便可靠,PMMA的介入并不影響CPC的特性,復(fù)合骨水泥材料隨著PMMA含量的逐漸增高,其機械性抗壓強度、抗拉伸強度和抗折強度也隨之增高,而體內(nèi)降解速度逐漸減慢,PMMA含量超過50%幾乎無法降解。2.復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA (75%、67%、50%)屬于無細胞毒性的生物材料,具有良好的細胞相容性。3.復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA無血液毒性,不引發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng),不具有全身亞急性毒性,無溶血性,具有良好的生物安全性,復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA (75%、67%、50%)組符合骨組織替代材料的基本條件。4.復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA修復(fù)SD大鼠脛骨臨界性骨缺損的效果較理想,可以認為75%-50%濃度范圍的復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA是一種具有骨引導(dǎo)活性、適用于負重或非負重區(qū)域骨移植的良好的生物性骨組織替代材料。
【關(guān)鍵詞】：磷酸鈣 聚甲基丙烯酸甲酯 骨水泥 生物學(xué)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08;R687
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-27
• 前言27-35
• 參考文獻31-35
• 第一部分 復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA的制備與材料性能檢測35-60
• 1 材料與方法35-42
• 1.1 實驗材料35-36
• 1.2 CPC與PMMA復(fù)合型骨水泥的制備36-38
• 1.3 CPC與PMMA復(fù)合型骨水泥理化性能檢測38-41
• 1.4 統(tǒng)計學(xué)方法41-42
• 2 結(jié)果42-52
• 2.1 抗壓實驗42-43
• 2.2 拉伸實驗43-45
• 2.3 三點彎實驗45-46
• 2.4 凝固溫度46-48
• 2.5 固化時間48-49
• 2.6 微孔孔徑結(jié)構(gòu)觀察與測量49-50
• 2.7 X射線衍射分析50-51
• 2.8 失重率測試51-52
• 3 討論52-56
• 參考文獻56-60
• 第二部分 復(fù)合型骨水泥CPC/PMMA生物安全性檢測60-83
• 1 材料與方法61-69
• 1.1 實驗材料61-62
• 1.2 實驗方法和步驟62-69
• 1.2.1 細胞毒性實驗62-64
• 1.2.2 全身亞急性毒性實驗64-65
• 1.2.3 熱源實驗65-66
• 1.2.4 致敏實驗66-67
• 1.2.5 溶血實驗67-68
• 1.2.6 病理學(xué)檢測68
• 1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理68-69
• 2 結(jié)果69-78
• 2.1 細胞毒性實驗(MTT實驗)69-71
• 2.2 全身亞急性毒性實驗71-76
• 2.3 熱源實驗76-77
• 2.4 致敏實驗77
• 2.5 溶血實驗77-78
• 3 討論78-81
• 3.1 細胞毒性實驗79-80
• 3.2 全身亞急性毒性實驗80
• 3.3 熱源實驗與致敏實驗80-81
• 3.4 溶血實驗81
• 參考文獻81-83
• 第三部分 CPC/PMMA復(fù)合型骨水泥修復(fù)SD大鼠脛骨臨界性骨缺損的實驗研究83-109
• 1 材料與方法85-89
• 1.1 主要儀器和實驗材料85-86
• 1.2 實驗材料和動物86
• 1.3 試劑的配制86
• 1.4 實驗分組86
• 1.5 建立骨水泥試件植入SD大鼠脛骨臨界性骨缺損動物模型及手術(shù)方法86-88
• 1.6 標本采集與處理88-89
• 1.7 數(shù)據(jù)處理89
• 2 結(jié)果89-95
• 2.1 動物一般情況89
• 2.2 骨水泥試件植入術(shù)后動物模型的X線檢查(術(shù)后4周,術(shù)后15周)89-95
• 3 討論95-104
• 3.1 新型骨材料在骨缺損修復(fù)中的研究現(xiàn)狀95-97
• 3.2 臨界性骨缺損動物模型建立的可行性97-98
• 3.3 CPC和PMMA體內(nèi)對骨骼的影響98-99
• 3.4 CPC/PMMA復(fù)合型骨水泥在臨界性骨缺損動物模型中的促成骨能力99-100
• 3.5 結(jié)論100-104
• 參考文獻104-109
• 全文總結(jié)109-110
• 綜述110-122
• 參考文獻117-122
• 中英文對照縮略詞表122-124
• 攻讀學(xué)位期間成果124-126
• 致謝126-128
• 研究生畢業(yè)論文統(tǒng)計學(xué)審稿證明128

，

本文編號：1011028