本文關鍵詞：環(huán)境毒物及癌癥標志物檢測的新型電化學生物傳感器研究

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【摘要】：隨著工農業(yè)的快速發(fā)展,大量污染物的排放造成嚴重的環(huán)境污染和生態(tài)資源破壞,使人類的生存環(huán)境和生命健康受到威脅。另一方面,隨著人類生活水平的提高,人們的健康意識逐漸增強。疾病是人體健康的主要威脅之一。疾病的早期診斷可以大大縮短治療時間,提高疾病的治愈率。環(huán)境污染和醫(yī)療水平與人體健康密切相關,成為了人們日常生活中關注的重中之重。那么,發(fā)展環(huán)境毒物與疾病標志物的無損、快速、高靈敏分析和檢測技術越來越引起研究者的關注。電化學生物傳感器是當前生物傳感器發(fā)展的熱點之一,它采用固定化生物分子或生物體作為敏感元件,以電極為換能器,通過檢測目標分析物與敏感元件反應引起的電信號的改變,實現(xiàn)對目標物的分析和檢測。電化學生物傳感器將電化學強大的分析功能與生物識別過程的特異性相結合,具有選擇性好、靈敏度高、儀器便攜、成本低等優(yōu)點,現(xiàn)已廣泛應用于環(huán)境監(jiān)測、食品安全、生物醫(yī)藥和軍事等領域。本論文著力于構建新型電化學生物傳感器,并將其應用于環(huán)境毒物分析檢測以及癌癥標志物的檢測。本論文主要研究內容和創(chuàng)新性工作如下：1.提出了一種無標記的實時高通量細胞阻抗傳感器用于重金屬毒性的檢測方法我們使用自行設計的高通量細胞阻抗傳感器及檢測儀器實時監(jiān)測了重金屬Hg2+、Cd2+、Pb2+的肝細胞毒性以及Zn2+對Cd2+的細胞毒性的抑制作用。實驗結果揭示了Cd2+、Pb2+和Hg2+的肝細胞毒性大小、作用速度等信息。同時,實驗結果表明Zn2+對Cd2+造成的細胞凋亡的拮抗程度是與Zn2+劑量有關的。一定劑量的Zn2+表現(xiàn)出對Cd2+造成的細胞毒性的抑制作用,然而高劑量的Zn2+會增強細胞毒性。Zn2+對細胞的保護作用可能是基于Zn2+的抗氧化特性和Zn2+占據(jù)了Cd2+在細胞上的結合位點。本文的結果可為Cd2+中毒的治療提供一定的參考。綜上所述,我們提供了一個高通量的化合物毒性初篩平臺,在環(huán)境毒物毒性評估和藥物篩選等領域有廣闊的應用前景。2.提出了一種基于T-Hg2+-T配位的電化學DNA傳感器用于Hg2+檢測方法本文首先使用納米金比色法對Hg2+進行檢測,對T-Hg2+-T錯配及其特異性進行驗證,然后提出一種基于T-Hg2+-T配位的電化學DNA傳感器檢測汞離子的方法。首先將含有若干個胸腺嘧啶的探針DNA通過Au-S鍵固定在電極表面,利用汞(Ⅱ)離子介導的T-Hg2+-T配對使得固定在電極上的探針DNA與檢測DNA發(fā)生偽雜交,從而將檢測DNA標記的二茂鐵引入電化學體系。通過檢測DNA上二茂鐵的電化學氧化電流,實現(xiàn)了對Hg2+的高靈敏電化學檢測。應用該方法可檢測到2.7nM的Hg2+,檢測范圍為5nM-200nM。實驗結果還表明該傳感器對Hg2+有較好的選擇性。3.研究了基于碳納米管的電化學酶傳感器用于軟海綿酸毒素快速檢測本文將碳納米管以鄰氨基苯酚電聚合的方法修飾在印刷電極表面,然后把蛋白磷酸酶PP2A固定在碳納米管修飾電極上。利用貝類毒素軟海綿酸對蛋白磷酸酶PP2A的抑制作用,以p-NPP為底物,通過檢測軟海綿酸對PP2A抑制作用引起的酶催化產物p-NP氧化電流的降低對軟海綿酸進行分析測定。由于碳納米管具有良好的理化特性,可以顯著改善電極的電化學性能,增加電極對酶的負載量,從而得到高靈敏的檢測結果。應用該方法可以檢測到0.67μg/L的軟海綿酸,比基于酶抑制的比色檢測法的檢測限低一個數(shù)量級,檢測范圍為1μg/L-300μg/L。此外,我們將此傳感器用于加標樣本的檢測,得到了較高的回收率。4.研究了基于磁珠的電化學免疫傳感器用于軟海綿酸毒素的高靈敏檢測選用羧基磁珠為載體,構建了基于競爭性免疫反應的電化學分析方法。修飾在磁珠表面的軟海綿酸與待測溶液中軟海綿酸競爭性地與HRP標記的軟海綿酸抗體發(fā)生免疫反應。形成的磁珠復合物在磁鐵作用下被捕獲到絲網印刷電極的工作電極上。利用辣根氧化物酶(HRP)的催化作用,使用差分脈沖伏安法,對軟海綿酸進行電化學測定。傳感器對軟海綿酸的檢測范圍為0.05μg/L-50μg/L,檢測下限降低到0.039μg/L。磁珠的使用使實驗操作的復雜性降低,檢測時間縮短,也減少了樣品中其它物質對檢測的干擾。實際樣品檢測結果表明本方法有應用于軟海綿酸現(xiàn)場檢測的潛力。5.研究了一種高靈敏直接型電化學免疫傳感器用于癌胚抗原的檢測利用納米金和蛋白A作為固定抗體的雙重放大基質。納米金比表面積大、良好的生物相容性促使更多的蛋白A吸附在電極表面。蛋白A.可與抗體的Fc段結合,使抗體定向固定在電極表面。癌胚抗原與電極上癌胚抗原抗體形成的免疫復合物阻礙了氧化還原對在電極表面的電子轉移。使用循環(huán)伏安法和阻抗譜掃描法對癌胚抗原進行檢測。其中阻抗譜掃描法更靈敏,檢測范圍為1pg/mL～100ng/mL,檢測限為0.1pg/mL。與文獻中報道的同種類型的電化學免疫傳感器相比,性能較好。此外,將該免疫傳感器用于血清加標樣品中癌胚抗原的檢測,也得到了較高的回收率。表明本方法在癌胚抗原的臨床檢測中具有較好的應用前景。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TP212;R115

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