發(fā)布時間：2018-05-07 06:03

  本文選題：嗎啡依賴 + Nurr1��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)發(fā)布的關(guān)于嗎啡濫用情況報告顯示,近年來嗎啡的濫用仍呈增高趨勢,導(dǎo)致了一系列嚴(yán)重不良后果。以往研究表明,嗎啡對全身各系統(tǒng)可造成不同程度的損害。如,對心、肺的損害,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接作用以及對呼吸中樞的抑制等,導(dǎo)致大腦急、慢性缺血低氧,進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)纖維發(fā)生相應(yīng)的損傷。以往研究證實中腦多巴胺系統(tǒng)幾乎參與了所有依賴性藥物的獎賞效應(yīng),被認(rèn)為是獎賞效應(yīng)的最后通路。中腦多巴胺神經(jīng)細(xì)胞以及它們的投射區(qū)域與神經(jīng)通路調(diào)節(jié)密切相關(guān),是一系列包括精神障礙以及成癮的形成與維持等適應(yīng)性變化的基礎(chǔ)。嗎啡依賴可導(dǎo)致中腦多巴胺系統(tǒng)一系列分子和細(xì)胞功能適應(yīng)性改變,使神經(jīng)結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑,成癮者失去抗拒藥物的能力,從而產(chǎn)生持續(xù)性的渴求及復(fù)吸。在參與中腦多巴胺神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育以及生理功能的眾多轉(zhuǎn)錄因子中,Nurr1(nuclear receptor related factor 1)和Pitx3(pituitary homeobox 3)發(fā)揮著重要的作用,它們不僅決定著多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的特性及傳遞,而且是多巴胺神經(jīng)細(xì)胞存活和維持的重要調(diào)控基因。Nurr1是孤兒核受體超家族中的一員,是中腦腹側(cè)背蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)和黑質(zhì)(substantia nigra,SN)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞以及中腦以外非多巴胺神經(jīng)細(xì)胞分化、遷移、成熟以及生存不可缺少的重要因子,同時還對參與多巴胺代謝相關(guān)基因酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮著重要的作用。另一個對多巴胺神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育以及生存和維持起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子是同源蛋白Pitx3。編碼Pitx3的基因只表達(dá)在中腦多巴胺神經(jīng)細(xì)胞中,并且它與其他相關(guān)因子共同作用參與多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的分化和維持。以往有研究顯示小鼠在給予可卡因注射后可以導(dǎo)致Nurr1和Pitx3表達(dá)量顯著性的降低,表明這些因子可以調(diào)節(jié)神經(jīng)適應(yīng)過程,從而引起多巴胺神經(jīng)環(huán)路的改變以及神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重塑,最終可能導(dǎo)致更為嚴(yán)重的神經(jīng)損傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是應(yīng)激細(xì)胞發(fā)揮自我保護(hù)的一種機(jī)制,但過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可造成組織細(xì)胞的病理性改變。目前的研究已證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不僅在神經(jīng)退行性疾病導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡和發(fā)病機(jī)制中起重要作用,而且在毒品依賴過程中同樣存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,但缺乏詳細(xì)的報道。發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)與未折疊或錯誤折疊蛋白結(jié)合,從而使其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白受體雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、1型跨膜蛋白激酶(inositol requirement 1,IRE1)和激活作用轉(zhuǎn)錄因子6(artificial transcription factor 6,ATF6)解離,從而激活這三條信號通路,促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊,對細(xì)胞具有保護(hù)作用。但是過強(qiáng)或者持續(xù)時間過長的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能,PERK和ATF6的啟動又會促進(jìn)CHOP的激活,增加其表達(dá)量,CHOP的高表達(dá)使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激達(dá)到頂峰,可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase12作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵分子,僅在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時被激活,在線粒體或死亡受體凋亡過程中不被激活。Caspase12從無活性酶原的形式發(fā)生重組,切割并激活caspase9酶原,繼而啟動caspase3經(jīng)典凋亡途徑,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此,caspase-12被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時的標(biāo)志性分子,在促凋亡通路中具有重要的作用。雖然目前的研究表明慢性嗎啡依賴可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷,但在損傷過程中中腦VTA和SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的病理性改變以及參與損傷的相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)變化及作用機(jī)制目前尚不清楚,因此,本研究旨在模擬人類長時程慢性嗎啡依賴的狀態(tài),建立不同時程慢性嗎啡依賴大鼠模型,從病理形態(tài)學(xué)角度觀察慢性嗎啡依賴對中腦VTA及SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的影響,同時對中腦多巴胺神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白Nurr1、Pitx3和TH以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP及凋亡蛋白caspase-12、caspsae-3在慢性嗎啡依賴導(dǎo)致的神經(jīng)損傷中的表達(dá)變化及相互作用關(guān)系進(jìn)行探討,為多巴胺神經(jīng)損傷的深入研究及新的藥物靶點的尋找提供新的途徑。第一部分不同時程慢性嗎啡依賴大鼠模型的建立以及病理學(xué)觀察目的:建立不同時程慢性嗎啡依賴大鼠模型,通過常規(guī)組織病理學(xué)染色、組織化學(xué)特殊染色及Fluoro-Jade B熒光標(biāo)記,觀察不同時程慢性嗎啡依賴對VTA及SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的影響。方法:1采用背部皮下遞增注射鹽酸嗎啡的方法,建立嗎啡依賴模型。通過鹽酸納洛酮皮下注射誘發(fā)戒斷癥狀,給予評分,確認(rèn)嗎啡依賴后建立不同時程慢性嗎啡依賴大鼠模型。2對各組大鼠體重進(jìn)行檢測,觀察不同時程慢性嗎啡依賴對大鼠體重的影響。3 HE染色觀察不同時程慢性嗎啡依賴大鼠中腦VTA和SN的病理學(xué)改變。4硫瑾染色觀察不同時程慢性嗎啡依賴大鼠中腦VTA和SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞尼氏體及形態(tài)改變。5 Fluoro-Jade B熒光染色檢測不同時程慢性嗎啡依賴大鼠VTA和SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞變性死亡的情況。結(jié)果:1嗎啡依賴各組出現(xiàn)明顯戒斷癥狀,對戒斷癥狀進(jìn)行評分,與正常對照組相比具有顯著性差異(P0.05),說明嗎啡依賴大鼠模型建立成功。2隨時間的延長正常對照組大鼠體重呈較明顯增加趨勢。嗎啡依賴組一周時體重略有下降,一周以后體重也呈增加趨勢,但與正常對照組體重相比,體重較低且具有顯著性差異(P0.05)。3 HE染色結(jié)果表明隨著慢性嗎啡依賴時間的延長,VTA和SN區(qū)組織出現(xiàn)水腫、噬神經(jīng)現(xiàn)象、膠質(zhì)細(xì)胞增生,細(xì)胞固縮。4硫瑾染色結(jié)果表明隨著慢性嗎啡依賴時間的延長,VTA和SN區(qū)組織出現(xiàn)結(jié)構(gòu)不清,細(xì)胞內(nèi)尼氏體排列不規(guī)則、消失,細(xì)胞固縮深染。5 Fluoro-Jade B染色結(jié)果表明VTA和SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生了變性死亡。小結(jié):本部分實驗在成功建立不同時程慢性嗎啡依賴大鼠模型的基礎(chǔ)上,通過HE染色、硫瑾染色、Fluoro-Jade B熒光標(biāo)記結(jié)果顯示:隨嗎啡依賴時間的延長,VTA及SN的多巴胺神經(jīng)細(xì)胞從最初的組織水腫、噬神經(jīng)現(xiàn)象、膠質(zhì)細(xì)胞增生、尼氏體消失逐漸演變?yōu)樯窠?jīng)細(xì)胞的死亡,提示長時程慢性嗎啡依賴可導(dǎo)致VTA及SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的變性死亡。第二部分不同時程慢性嗎啡依賴對中腦多巴胺相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白Nurr1,Pitx3,TH表達(dá)的影響目的:通過系統(tǒng)觀察多巴胺調(diào)節(jié)蛋白Nurr1、Pitx3和TH的表達(dá)變化以及相互之間的關(guān)系,明確Nurr1、Pitx3和TH是否參與了慢性嗎啡依賴導(dǎo)致的神經(jīng)損傷,為慢性嗎啡依賴導(dǎo)致神經(jīng)損傷的機(jī)制研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù),為嗎啡導(dǎo)致神經(jīng)損傷的治療提供新途徑。方法:1免疫組化觀察不同時程慢性嗎啡依賴對VTA及SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物TH的影響。2免疫熒光雙標(biāo)觀察不同時程慢性嗎啡依賴對VTA及SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白Nurr1和Pitx3的影響及與TH的相關(guān)關(guān)系。3 Western blot檢測不同時程慢性嗎啡依賴對VTA及SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞中TH、Nurr1和Pitx3蛋白含量的影響。結(jié)果:1 VTA和SN免疫組化TH檢測結(jié)果:隨嗎啡依賴時間的延長TH陽性細(xì)胞數(shù)目逐漸減少。2 VTA和SN免疫熒光雙重標(biāo)記:Nurr1與TH、Pitx3與TH的雙重標(biāo)記顯示Nurr1和Pitx3陽性細(xì)胞數(shù)目隨嗎啡依賴時間的延長呈明顯減少趨勢。3 Western blot檢測VTA和SN TH蛋白表達(dá)結(jié)果:與正常對照組相比嗎啡依賴1周組表達(dá)少量上調(diào),但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);隨嗎啡依賴時間的延長,嗎啡依賴3周組與正常對照組相比表達(dá)降低(P0.05),嗎啡依賴6周組與正常對照組相比表達(dá)明顯降低(P0.01)。4 Western blot檢測VTA和SN Nurr1、Pitx3蛋白表達(dá)結(jié)果:與正常對照組相比嗎啡依賴1周組表達(dá)上調(diào)(P0.05),隨嗎啡依賴時間的延長,與正常對照組相比嗎啡依賴3周組表達(dá)降低(P0.05),與正常對照組相比嗎啡依賴6周組表達(dá)明顯降低(P0.05)。小結(jié):慢性嗎啡依賴使多巴胺調(diào)節(jié)因子Nurr1、Pitx3的表達(dá)降低,不能有效調(diào)控TH的表達(dá),多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的生存受到了影響,導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的明顯損傷。提示慢性嗎啡依賴中Nurr1、Pitx3及TH表達(dá)的降低可能是引發(fā)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要途徑之一。第三部分不同時程慢性嗎啡依賴對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響目的:通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3的表達(dá)變化,探討慢性嗎啡依賴導(dǎo)致的多巴胺神經(jīng)細(xì)胞損傷,是否有上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白及凋亡蛋白的參與,為依賴性藥物導(dǎo)致的神經(jīng)損傷的防治提供科學(xué)依據(jù)。方法:1多重?zé)晒鈽?biāo)記,共聚焦顯微鏡觀察不同時程慢性嗎啡依賴VTA及SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78,P-e IF2α,ATF6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3的表達(dá)變化。2 Western blot檢測不同時程慢性嗎啡依賴VTA及SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78以及CHOP蛋白半定量變化。結(jié)果:1免疫熒光多重標(biāo)記VTA和SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP、Caspase-12、caspsae-3與TH免疫熒光多重標(biāo)記(激光共聚焦顯微鏡觀察):隨慢性嗎啡依賴時間的延長,GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP與TH共表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)了先增加后略降低的趨勢;Caspase-12、caspsae-3陽性表達(dá)隨嗎啡依賴時間延長呈現(xiàn)升高趨勢。2 Western blot檢測VTA和SN區(qū)GRP78、CHOP蛋白半定量結(jié)果顯示,與正常對照組相比隨嗎啡依賴時間的延長,蛋白表達(dá)呈現(xiàn)了先增加后略降低的趨勢(P0.05),與免疫熒光多重標(biāo)記結(jié)果相一致。小結(jié):慢性嗎啡依賴可導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3的表達(dá)變化。其中PERK,ATF-6信號通路的激活,導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白CHOP的表達(dá)增高,同時凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3表達(dá)也呈現(xiàn)了上調(diào)趨勢。提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活可能通過誘導(dǎo)凋亡而參與慢性嗎啡依賴導(dǎo)致的多巴胺神經(jīng)細(xì)胞損傷。第四部分不同時程嗎啡刺激對多巴胺性MN9D細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響目的:檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3在不同時程嗎啡刺激后的表達(dá)變化,進(jìn)一步印證整體實驗結(jié)果。方法:1免疫熒光標(biāo)記MN9D細(xì)胞及SH-SY5Y細(xì)胞中TH表達(dá)情況,并比較其數(shù)量。2 MTT檢測不同濃度嗎啡刺激MN9D細(xì)胞生存率。3免疫熒光檢測不同時程嗎啡刺激MN9D細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF-6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3表達(dá)變化。4原位末端標(biāo)記(TUNEL)檢測MN9D細(xì)胞中凋亡情況。結(jié)果:1 MN9D細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞中部分細(xì)胞TH呈陽性表達(dá),且MN9D細(xì)胞TH陽性細(xì)胞數(shù)目較SH-SY5Y細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)目多,且存在明顯差異(P0.05)。2 MTT檢測結(jié)果表明:1μM嗎啡作用MN9D細(xì)胞24h后,MN9D細(xì)胞存活率顯著下降(P0.05),且MN9D細(xì)胞的存活率隨著嗎啡藥物濃度的升高而降低。3免疫熒光染色結(jié)果表明隨著嗎啡刺激時間的延長,MN9D細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF-6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3的表達(dá)增加。4原位末端標(biāo)記(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡:正常對照及嗎啡刺激24h未見凋亡細(xì)胞,嗎啡刺激48h可見個別凋亡細(xì)胞,72h可見散在凋亡細(xì)胞。小結(jié):1 MN9D細(xì)胞中的TH陽性細(xì)胞數(shù)目明顯多于SH-SY5Y細(xì)胞是多巴胺成癮機(jī)制深入研究理想的細(xì)胞系。2隨嗎啡刺激時間的延長MN9D細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、ATF-6、P-e IF2α、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3表達(dá)增高參與了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。結(jié)論:本研究以不同時程慢性嗎啡依賴大鼠模型為主要研究對象,結(jié)合體外嗎啡刺激細(xì)胞模型系統(tǒng)觀察嗎啡對VTA及SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞及多巴胺性MN9D細(xì)胞的影響,得出以下結(jié)論:1慢性嗎啡依賴可導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)細(xì)胞損傷。2 Nurr1、Pitx3及TH表達(dá)的降低影響了細(xì)胞的生存,可能參與了慢性嗎啡依賴導(dǎo)致的多巴胺神經(jīng)細(xì)胞損傷。3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活及其下游凋亡的發(fā)生可能參與慢性嗎啡導(dǎo)致的多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的損傷。綜上,慢性嗎啡導(dǎo)致的VTA及SN多巴胺神經(jīng)細(xì)胞損傷,一方面是相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)變化影響了多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的生存,另一方面是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白及凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：D919
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本文編號：1855694