本文關(guān)鍵詞：母胎間差異DNA甲基化標(biāo)記的篩選與鑒定　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景 胎兒產(chǎn)前親子鑒定在法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定中占有重要的地位。傳統(tǒng)的胎兒產(chǎn)前親子鑒定通常需要穿刺抽取羊水、臍血或絨毛取樣,但這些侵入性取樣存在流產(chǎn)、宮內(nèi)感染、胎兒損傷等風(fēng)險,而且還會受到妊娠時間的限制。長期以來,探索無創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親子鑒定方法一直是法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題。研究發(fā)現(xiàn),孕期母血中含有多種胎兒細(xì)胞及胎兒游離核酸。前者因在母血中含量太少,且難以分離和富集,致使其在胎兒產(chǎn)前親子鑒定中的應(yīng)用價值有限;后者為法醫(yī)學(xué)無創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親子鑒定帶來了新的契機(jī)。目前,盡管在利用孕母血中cffDNA進(jìn)行胎兒產(chǎn)前親子鑒定方面取得了一些進(jìn)展,但仍存在以下問題：①cffDNA少,難以富集,加之片段很小,致使可檢出的胎兒遺傳標(biāo)記有限;②因大量母體DNA的干擾,檢測結(jié)果均為母親和胎兒的混合基因型,使得父權(quán)判斷的統(tǒng)計學(xué)評估更為復(fù)雜。表觀遺傳學(xué)的最新研究成果證實(shí),母親和胎兒DNA之間存在眾多的DMR,這些DMR的發(fā)現(xiàn)不僅為臨床進(jìn)行無創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前診斷奠定了基礎(chǔ),亦為法醫(yī)學(xué)進(jìn)行無創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親權(quán)鑒定提供了新的技術(shù)手段。與臨床上無創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前診斷不同的是,法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定必需進(jìn)行基因分型。由此,母胎間DMR內(nèi)的SNP位點(diǎn)自然成了關(guān)注的對象。聯(lián)合分析差異甲基化標(biāo)記和SNP位點(diǎn)成為進(jìn)行無創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親子鑒定的全新策略�；诖�,母胎間差異DNA甲基化標(biāo)記的篩選與鑒定便成為利用表觀遺傳學(xué)標(biāo)記進(jìn)行無創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親子鑒定非常重要的基礎(chǔ)性工作。目的 在全基因組范圍內(nèi)篩選母胎間存在顯著DNA甲基化差異且含有頻率較好的SNP位點(diǎn)的DMR,為利用表觀遺傳學(xué)進(jìn)行無創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親子鑒定提供候選標(biāo)記。方法 ①采用甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)結(jié)合啟動子區(qū)及CpG島芯片(NimbleGen HG18 CpG Promoter),以母體外周血以及胎兒胎盤絨毛膜(CVS)為研究對象,系統(tǒng)檢測母胎間DNA甲基化水平差異：②利用重亞硫酸鹽測序技術(shù)對芯片篩選的DMR進(jìn)行驗(yàn)證；③挑選部分含SNP標(biāo)記以及甲基化敏感的限制酶酶切位點(diǎn)的片段,以孕母外周血血漿中的cffDNA進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,評價其作為母體循環(huán)中胎兒表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物的特異性、穩(wěn)定性與靈敏度。結(jié)果①根據(jù)甲基化芯片檢測結(jié)果,以PeakDMvalue0.5為標(biāo)準(zhǔn),共發(fā)現(xiàn)185個母親組高甲基化區(qū)域以及303個母親組低甲基化區(qū)域。488個DMR中,75個(15.37%)位于CpG島區(qū)域413個(84.63%)位于啟動子區(qū)域。母親組高甲基化片段中,18個(5.94%)位于CpG島,285個(94.06%)位于啟動子區(qū)域。上述DMR隨機(jī)分布在所有的染色體上,其中1號染色體上最多,有42個,其次是19號染色體35個、5號染色體30個、22號染色體30個、17號染色體27個、11號染色體25個、7號染色體24個。利用數(shù)據(jù)庫信息,以DM value0.5、SNP頻率0.2為標(biāo)準(zhǔn),初步篩選出91個符合條件的DMR。然后根據(jù)DM值、甲基化差異程度、SNP頻率以及酶切位點(diǎn)的位置等因素綜合考慮,最終選擇了15個DMR作后續(xù)BSP的驗(yàn)證分析。②驗(yàn)證的15個DMR中,與芯片結(jié)果一致并且含有與SNP位點(diǎn)鄰近的MSRE酶切位點(diǎn)的DMR有3個。③3個靶DMR中,chr10O:101281722-101282479片段(NCBI36/hg18)在六對樣本中母親DNA均可被BstUI和HinP1I雙酶完全切割,胎兒絨毛DNA均不能被切割。其它兩個片段chr9:138021600-138022048(NCBI36/hg18)以及cht17：34251133-34251505(NCBI36/hg18)的酶切情況體現(xiàn)出了一定的個體差異。結(jié)論在全基因組范圍內(nèi)篩選出1個完全滿足要求的靶DMR,可作為進(jìn)行無創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親子鑒定的有效標(biāo)記。其余2個DMR存在個體差異,僅能滿足部分個體的鑒定要求。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：D919.4

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本文編號：1354270