熒光PCR熔解曲線法快速診斷耐藥結(jié)核病的臨床應(yīng)用評估
【摘要】 本文主要包含兩個(gè)部分,第一部分建立了一種磁珠法提取結(jié)核分枝桿菌核酸的方法,并對其進(jìn)行優(yōu)化,證明了其有效性。第二部分通過檢測臨床標(biāo)本,對熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥突變試劑盒進(jìn)行了較全面的評估,闡述了該試劑盒在臨床應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)。結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁厚,難以破裂,同時(shí),結(jié)核病患者的痰液中含有大量的呼吸道分泌物及粘蛋白等成分,這些因素對結(jié)核分枝桿菌核酸的提取帶來了不利影響,直接影響了后續(xù)的快速診斷。我們建立了一種利用磁珠進(jìn)行吸附的提取方法,通過加熱和裂解液對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行破壁,依靠磁珠對核酸的吸附能力,多次洗脫痰液中殘留的抑制成分,最終得到質(zhì)量較高的核酸。我們對提取過程中的加熱時(shí)間,液化液用量以及裂解洗脫次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,最終得到了較為完善的提取方案。通過模擬陽性痰液我們考察了該方法的靈敏度,結(jié)果顯示,在200CFU/mL以上含量的痰液中提取的核酸都能有效的進(jìn)行PCR擴(kuò)增。我們還對140份臨床標(biāo)本進(jìn)行了提取檢測,其中85份鏡檢陽性標(biāo)本中都能有效提取到核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測,靈敏度達(dá)到100%,鏡檢陰性痰中也有提取到,這可能是由于抗酸染色鏡檢的局限性以及PCR檢測方法的特異性造成的。我們對200份臨床標(biāo)本進(jìn)行了藥物敏感性試驗(yàn)和四種(利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇)熒光PCR熔解曲線法檢測試劑盒快速檢測。對結(jié)果進(jìn)行了一個(gè)對比,結(jié)果發(fā)現(xiàn),利福平突變檢測試劑盒的靈敏度為100%,特異性為97.8%；異煙肼突變檢測試劑盒的靈敏度為94.4%,特異性為98.8%；鏈霉素突變檢測試劑盒的靈敏度為85.3%,特異性為98.2%；乙胺丁醇突變檢測試劑盒的靈敏度為90.9%,特異性為97.9%。表明四種試劑盒的特異性均較高,其中利福平突變檢測試劑盒的靈敏度最高。該結(jié)果表明四種試劑盒在靈敏度和特異性方面具有較好的性能。我們還通過對605份臨床標(biāo)本的檢測,從檢測時(shí)間、檢測水平、試劑盒穩(wěn)定性、污染情況、不同儀器的對比、結(jié)果判讀復(fù)雜性等多個(gè)方面對六種試劑盒進(jìn)行了考察評估。從臨床標(biāo)本核酸的提取到完成六種藥物突變檢測,在2-3天內(nèi)即可完成,與傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)相比大大縮短了檢測時(shí)間,這是熒光PCR熔解曲線法檢測耐藥情況具有的最大優(yōu)勢。我們對六種試劑盒的檢測水平進(jìn)行了考察,每種試劑盒的檢測底線略有不同,其中氟喹諾酮突變檢測的水平最強(qiáng)。我們對放置10天、一個(gè)月、二個(gè)月、三個(gè)月的試劑盒進(jìn)行了評估,發(fā)現(xiàn)三個(gè)月內(nèi)試劑盒檢測性能變化不大,第三個(gè)月時(shí)開始出現(xiàn)小幅下降。在污染方面,六種試劑盒發(fā)揮了良好的性能,整個(gè)檢測過程中只出現(xiàn)了3次污染,而傳統(tǒng)培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)有15次污染。在上述的評估中,試劑盒都發(fā)揮了其優(yōu)秀的性能,但是,試劑盒在結(jié)果判讀方面還有需要改進(jìn)的地方,容易出現(xiàn)一些難以判定的結(jié)果,對結(jié)果判讀人員的理論知識有一定的要求。綜合多方面的評估結(jié)果,我們認(rèn)為,熒光PCR熔解曲線法是簡單快速、可靠實(shí)用的檢測技術(shù),基于該方法的試劑盒具有靈敏度高、特異性好、能有效避免污染的優(yōu)良特點(diǎn),具有較好的臨床應(yīng)用意義。
第一章緒論
1.1結(jié)核病概述
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性熏染性疾病，可累及滿身各器官，最常見的抱病部位是肺部，重要通過呼吸道、消化道和皮膚等方法舉行流傳熏染。結(jié)核菌進(jìn)入人體后被巨嗟細(xì)胞吞瞭，細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的存在和恒久存活引發(fā)的宿主免疫反響是影響發(fā)病、疾病歷程和轉(zhuǎn)歸的決定用性因素。結(jié)核病的特性性病理轉(zhuǎn)變是肉芽腫性病變和結(jié)核結(jié)節(jié)。其根本病理變革為排泄性病變、增素性病變和壞去世性（變質(zhì)性）病變[1，2]。
結(jié)核病可以分為五大類:原發(fā)性肺結(jié)核、血行播散性肺結(jié)核、繼發(fā)性肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎、其他肺外結(jié)核。
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1. 2結(jié)核病的流行
1.2.1國際情況
結(jié)核病是一種危害全人類的重大傳染病，20世紀(jì)在全球范圍內(nèi)結(jié)核病經(jīng)歷了三次回升[4]，前兩次與兩次世界大戰(zhàn)的爆發(fā)有直接原因，第三次的回升與人口流動(dòng)、耐多藥結(jié)核病的發(fā)生、HIV感染等有密切關(guān)系。目前，世界上所有的國家都處在結(jié)核病的威脅之下。1998年世界衛(wèi)生組織對會(huì)員國進(jìn)行了一次結(jié)核病疫情調(diào)查，結(jié)果顯示，大多數(shù)發(fā)展中國家和部分發(fā)達(dá)國家疫情繼續(xù)上升[5]，只有少數(shù)發(fā)達(dá)國家的結(jié)核病疫情能保持下降。全世界大約有1/3的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，活動(dòng)性結(jié)核病人達(dá)2000萬，每年約有800-1000萬新發(fā)結(jié)核病人[6]，近300萬人死于結(jié)核病。
據(jù)世界衛(wèi)生組織2010年全球結(jié)核病控制報(bào)告[7], 2009年全球約有940萬例新發(fā)結(jié)核病患者（相當(dāng)于每100, 000人中有137例患者），患者總?cè)藬?shù)每年都在輕微的上漲，其中婦女有330萬，占總數(shù)的35%。940萬新發(fā)結(jié)核病中有55%發(fā)生在亞洲，30%發(fā)生在非洲，7%發(fā)生在地中海東部，4%發(fā)生在歐洲，3%發(fā)生在美洲。
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第二章磁珠法提取結(jié)核分枝桿菌的核酸
第一節(jié)前言
目前，結(jié)核分枝桿菌核酸提取的方法有很多，包括酷氯仿抽提法、非有機(jī)溶劑提取法（鹽析法）、固相吸附提取法等，在這些方法中，固相吸附法更簡便和易于自動(dòng)化，同時(shí)，因?yàn)闆]有有機(jī)溶劑的參與，不會(huì)有酷類物質(zhì)殘留，處理?xiàng)l件比較溫和，對核酸的損傷較小。KathrynA等人對二氧化掛吸附材料做了大量研究，在pH較低的高離子緩沖液中，二氧化桂容易吸附帶有負(fù)電荷的物質(zhì)，而DNA的憐酸骨架帶有負(fù)電荷，易被吸附，同時(shí)生成大量的水和離子，更驅(qū)使核酸集聚到二氧化桂的表面。結(jié)合緩沖液能使核酸構(gòu)象發(fā)生改變，與二氧化娃表面形成氫鍵，被二氧化娃吸附。當(dāng)二氧化娃所處的環(huán)境pH值升高后，以上的作用力正好相反，于是就從二氧化桂表面洗脫下來。正基于二氧化桂的這種優(yōu)良特性，使其成為很好的固相吸附材料，本研宄就采用二氧化桂包被的磁珠進(jìn)行核酸提取。
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第二節(jié)材料和方法
2.1材料
主要儀器:
垂直超凈工作臺(tái) 廈門碧杭儀器有限公司
微量振蕩器 德國IKA公司
1.5ml離心管臺(tái)式高速離心機(jī) 廈門聯(lián)儀通有限公司
羅氏LightCycler480 瑞士羅氏公司
移液槍 Eppendorf公司
恒溫器 PeQLab公司
ND-1000微量紫外/可見分光光度計(jì)Thermo Fisher Scientific 美國
主要試劑：
痰液液化液：包含2%NaOH溶液；0.5%NALC (N-乙酰-L-半腕氨酸）溶液；1.45%梓檬酸鈉溶液。
PBS 緩沖液（pH=6.8);
TE 溶液：DNA 提取液，包含 lOmMTris-HCl (pH=8.0)； ImMEDTA (乙二胺四乙酸）溶液；
TET 溶液：包含 lOmM Tris-HCl (pH=8.0)； ImM EDTA (乙二胺四乙酸）溶液；1%TX-100;
ImM DTT溶液：將0.27gDTT溶解于600 U L去離子水中。
Lab-Aid核酸（DNA)分離試劑盒（磁珠法)：廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn)。
H37RV標(biāo)準(zhǔn)菌株滅活菌液：由深圳市慢性病防治中心提供。
標(biāo)本：100份結(jié)核陰性痰標(biāo)本，來源于廈門市中山醫(yī)院呼吸科和實(shí)驗(yàn)室志愿者。主要用于核酸提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。140份（85份陽性55份陰性）痰標(biāo)本，來源于廈門市疾病控制中心，主要用于提取方法的檢驗(yàn)。
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第三章 熒光PCR熔解曲線法快速診斷結(jié)核分枝桿菌耐藥性的臨床應(yīng)用評價(jià) .............40-67
第一節(jié) 引言 ...............40-42
第二節(jié) 材料和方法 ..............42-54
3.1 材料 ................42-43
3.1.1 主要器材 ............42
3.1.2 主要試劑 ..............42-43
3.2 方法 ...............43-54
3.2.1 結(jié)核分枝桿菌核酸提取 ...............43-44
3.2.2 MTBC快速檢測 ..............44-45
3.2.3 結(jié)核分枝桿菌耐藥突變的快速檢測 .............45-49
3.2.4 結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng) ............49-50
3.2.5 結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn) ..........50-51
3.2.6 熒光PCR熔解曲線法快速檢測與藥敏試驗(yàn)對比試驗(yàn) ...............51-52
3.2.7 快速診斷試劑盒性能評價(jià)試驗(yàn)........... 52-54
第三節(jié) 結(jié)果和結(jié)論 ............54-65
3.3.1 熒光PCR熔解曲線法快速檢測與藥敏試驗(yàn)對比試驗(yàn) .........54-56
3.3.2 檢測時(shí)間評價(jià)結(jié)果 ....................56
3.3.3 試劑盒檢測水平的評價(jià)................. 56-59
3.3.4 不同儀器檢測的評價(jià)結(jié)果 ..............59-61
3.3.5 試劑盒穩(wěn)定性評價(jià)結(jié)果 ...............61-62
3.3.6 污染情況評價(jià)結(jié)果................ 62
3.3.7 結(jié)果判讀復(fù)雜性評價(jià)結(jié)果 ................62-64
3.3.8 其它評價(jià)結(jié)果 .............64-65
討論
由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，使得傳統(tǒng)的檢測方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測技術(shù)不斷出現(xiàn)，給結(jié)核病的診斷和治療帶來了新的生機(jī)，診斷時(shí)間大量縮短，操作上也越來越簡單，這些技術(shù)有的已經(jīng)走向市場或者已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。其中，李慶閣教授及其課題組發(fā)明的焚光PCR恪解曲線法也正在轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品，部分檢測試劑盒己經(jīng)走向市場。產(chǎn)品的性能雖然在研發(fā)階段經(jīng)過了大量的測試和考察。但是，仍然缺乏大量臨床的使用情況數(shù)據(jù)。本章節(jié)就是通過對大量臨床標(biāo)本的檢測來從多個(gè)方面考察試劑盒的性能。
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總結(jié)
綜合多方面的評估結(jié)果，我們認(rèn)為，熒光PCR熔解曲線法是簡單快速、可靠實(shí)用的檢測技術(shù)，基于該方法的試劑盒具有靈敏度高、特異性好、能有效避免污染的優(yōu)良特點(diǎn)，具有較好的臨床應(yīng)用意義。
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本文編號：9105
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